食品中蛋白质含量的测定*

林智

（辽宁职业学院基础部，辽宁铁岭112000）

食品中蛋白质含量的测定*

林智

（辽宁职业学院基础部，辽宁铁岭112000）

我国现行标准GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》中的两种方法“凯氏定氮法”和杜马斯（Dumas）燃烧法是先将样品硝化后测出含氮量，然后根据氮元素与蛋白质换算系数计算蛋白质的含量，如果添加含氮量高的物质，如三聚氰胺，就可以测出较高的“蛋白质含量”。介绍4种直接测定蛋白质的方法：考马斯亮兰法、双缩脲法、Folin－酚试剂法和紫外吸收光谱法，可以避免上述由于添加违规化学物质造成测定蛋白质含量虚高的结果。

蛋白质含量；考马斯亮兰法；双缩脲法；Folin－酚试剂法；紫外吸收光谱法

2008 年毒奶粉事件再次敲响了食品安全的警钟，不法分子为了提高掺水牛奶中蛋白质的含量，添加工业原料三聚氰胺，由于我国现行标准GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》中的2种方法“凯氏定氮法”和杜马斯（Dumas）燃烧法只能测出含氮量，然后根据氮元素与蛋白质换算系数计算蛋白质的含量，但并不能区分牛奶硝化后氮的来源，如果添加违规化学物质，就可以测出较高的“蛋白质含量”。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，只要含氮量大于牛奶中蛋白质的化学物质，且性状和价格具备条件，在理论上都存在被不法分子利用的可能性。“定氮”方法的先天不足要求采用其它的检测方法来应对，下面介绍几种直接测定蛋白质的方法。

1 直接测定蛋白质方法

1.1 考马斯亮兰法

1976 年由Bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。在酸性溶液中，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合变为兰色，在595 nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。此法灵敏度较高1～5μg，时间15 min左右，干扰物质：强碱性缓冲溶液；SDS；TritonX-100。标准曲线有轻微的非线性，各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

1.1.1 实验用品

标准蛋白质溶液：用g-球蛋白或牛血清蛋白（BSA），配制成1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液。

考马斯亮兰G-250染料试剂：称100 mg考马斯亮兰G—250，溶于50 mL 95%的乙醇后，再加入120 mL 85%的磷酸，用水稀释至1 L。

可见光分光光度计；旋涡混合器；比色管；吸量管。

1.1.2 实验步骤

（1）标准曲线的制作：取7支比色管，分别加入0.00，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mL的1.0 mg/mL标准蛋白质溶液，然后用无离子水补充到0.1 mL。最后各试管中分别加入5.0 mL考马斯亮兰G—250试剂，每加完1管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。加完试剂2～5 min后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595 nm处的光吸收值。用标准蛋白质量（mg）为横坐标，用吸光度值为纵坐标，作图，即得到一条标准曲线。

（2）未知样品的测定：处理样品，稀释使其蛋白质质量浓度在1～10 mg/mL范围内,取3支比色管分别加0.02，0.04，0.06 mL未知样，用无离子水补充到0.1 mL，分别加入5.0 mL考马斯亮兰G—250试剂，在旋涡混合器上混合，在分光光度计上测定各样品在595 nm处的光吸收值，根据测出的未知样品的吸光度值，由标准曲线，既可查出未知样品的蛋白质含量。

1.2 双缩脲法[1-3]

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4结合形成红紫色络合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能发生双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，蛋白质的种类虽不同，但发色率差别不大，组氨酸以外其它游离的氨基酸、二肽等不显色，除双缩脲、一亚氨基双缩脲、二亚氨基双缩脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少数化合物以外，非蛋白质均不显色，可以看做这是蛋白质的特有反应，故可用来测定蛋白质含量。此法灵敏度较低1～20 mg，时间30 min左右，干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等，常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

1.2.1 试剂与器材

标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10 mg/mL的标准蛋白溶液，可用BSA质量浓度1 mg/mL的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清蛋白用H2O或质量分数为0.9%的NaCl配制，酪蛋白用0.05 mol NaOH配制。

双缩脲试剂：称以1.50 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0 g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500 mL水溶解，在搅拌下加入300 mL质量分数为10%的NaOH溶液，用水稀释到1 L，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

紫外光分光光度计；比色管；旋涡混合器等。

1.2.2 实验步骤

（1）标准曲线的测定：取12支比色管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1 mL，然后加入4 mL双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30 min，于540 nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取2组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，吸光度值为纵座标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：处理样品,稀释使其蛋白质质量浓度在1～10 mg/mL范围内，取3支比色管分别加0.02，0.04，0.06 mL未知样，用上述同样的方法，测定未知样品的吸光度值。根据测出的未知样品的吸光度值，由标准曲线，既可查出未知样品的蛋白质含量。

1.3 Folin－酚试剂法[2-3]

酚试剂法就是来自酚试剂（磷钼酸、磷钨酸的混合液），在碱性条件下，和蛋白质中芳香族氨基酸的呈色反应与双缩尿反应的复合方法。磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。此法灵敏度高5μg左右，时间1 h左右，干扰物质：尿素、硫酸纳、硝酸纳、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等，测定时要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

1.3.1 试剂与器材

试剂甲：（A）10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500 mL蒸馏水中。（B）0.5 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100 mL蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。

试剂乙：在2 L磨口回流瓶中，加入100 g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25 g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700 mL蒸馏水，再加50 mL85%磷酸，100 mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10 h，回流结束时，加入150 g硫酸锂（Li2SO4），50 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1 L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1 mol左右。

标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，质量浓度为250 mg/mL左右。牛血清蛋白溶于水若混浊，可改用质量分数为0.9%的NaCl溶液。

可见光分光光度计；旋涡混合器；秒表；比色管。

1.3.2 实验步骤

（1）标准曲线的测定：取16支比色管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL标准蛋白质溶液（质量浓度为250 mg/mL）。用水补足到1.0 mL，然后每支试管加入5 mL试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10 min。再逐管加入0.5 mL试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30 min，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700 nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5 mL试剂甲后，开始计时，1 min后，第2支试管加入5 mL试剂甲，2 min后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10 min，则第1支试管可立即加入0.5 mL试剂乙，1 min后第2支试管加入0.5 mL试剂乙，2 min后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30 min，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。

（2）样品的测定：取1 mL样品溶液（其中约含蛋白质20～250 μg），按上述方法进行操作，取1 mL蒸馏水代替样品作为空白对照。测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

1.4 紫外吸收光谱法[2-3]

紫外吸收光谱法是直接测定芳香族氨基酸对紫外线吸收光谱（酪氨酸和色氨酸的最大吸收为280nm）及肽键对紫外线吸收光谱（肽键的最大吸收为190 nm）来定量蛋白质的一种分析方法。

1.4.1 试剂与器材

97%（质量分数）醋酸溶液；紫外分光光度计。

1.4.2 实验步骤

（1）标准曲线的测定：用移液管吸取牛乳0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL分别置于5只洗净烘干的比色管中，以质量分数为97%的醋酸溶液定容至25 mL。摇动1 min，于紫外分光光度计用1 cm的比色皿于280 nm测定其吸光度。绘制标准曲线。

（2）样品的测定：用移液管准确吸取牛乳样品0.3 mL，操作同上。由标准曲线可计算出样品中蛋白质的百分数。

2 结束语

综上，这几种直接测定食品中蛋白质的方法，灵敏度高低不同，可以满足不同类型蛋白质的检测，可防止不法分子用添加违规化学物质来获得较高的蛋白质。当然，为了确保食品安全，食品检测还是应该根据实际情况采取不同的检测方法或同时用几种方法互相验证，这样才能不给不法分子可乘机会，确保食品安全。

[1]吴梧桐.生物化学[M].北京：人民卫生出版社，2007.

[2]陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M].北京：科学出版社，2002.

[3]陈雅蕙.生物化学实验原理和方法[M].2版.北京：北京大学出版社，2008.

[4]陈来同.生化工艺学实验教程[M].北京：科学出版社，2007.

[5]武汉大学.分析化学[M].5版.北京：高等教育出版社，2006.

The Determination of the Protein Content in Food

LIN Zhi

（Liaoning Vocational College Department of Basic Courses，Liaoning Tieling 112000，China）

According to the current standard of Determination of Protein Content in Food GB/T5009.5-2003 in China，there are two methods to determine the protein content.They are Kjeldahl method of nitrogen determination and Dumas method.Both of the two ways determine the nitrogen content by nitrification firstly and then calculate the protein content according to the conversion coefficient between the nitrogen and protein.If such high nitrogen content chemical substance as Melamine is added to the food，the protein content will be higher accordingly.In this peper，four direct determination methods were introduced including Bradford method，Biuret method，Lowry method and ultraviolet absorption spectrometry.These methods are more precise to determine the protein content in food than Kjedahl method which often overstates the protein content due to adding the high nitrogen-containing substances.

Protein Content；Bradford method；Biuret method；Lowry method；Ultraviolet Absorption Spectrometry

TQ937

A

1671-0460（2010）02-0224-03

2009-12-01

林智（1970-），男，讲师，毕业于青岛海洋大学化学系化学专业。E-mail：lzsllljp@163.com。