小鹅瘟马源高免血清的制备及应用*

李 琳,邵洪泽,任科研,毛文智,许志林,姚新华

(吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130062)

小鹅瘟马源高免血清的制备及应用*

李 琳,邵洪泽,任科研,毛文智,许志林,姚新华*

(吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130062)

采用JLDA株小鹅瘟抗原,高免马匹后经采血精制可获得滴度为1∶64～1∶128的抗小鹅瘟高免血浆。通过胃蛋白酶消化-硫酸铵盐析的工艺,得到小鹅瘟马源高免血清。按0.5 mL/羽剂量共预防雏鹅52.48万羽,按1 mL/羽～3 mL/羽剂量共治疗感染雏鹅5.66万羽,证实该抗血清效价高,对雏鹅的预防保护率为95.58%,对感染雏鹅的治愈率为92.87%,表明对小鹅瘟防治安全高效。马采血量大,成本低,同时有效地避免了同源动物间其他疫病的感染和强毒的散播,较之用鹅作为血清来源动物经济和社会效益显著。

小鹅瘟;鹅细小病毒;马源高免血清;制备;应用

*通讯作者

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus virus,GPV)引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病,主要发生于1月龄内雏鹅和雏番鸭,以渗出性肠炎、小肠黏膜表层大片坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变的一种烈性传染病。该病病程短、传染性强、病死率高,10日龄内雏鹅发病率和死亡率可达100%,在易感群中的致死率高达70%。近几年,随着吉林省养鹅业发展和品种交换,以及高密度饲养增加,小鹅瘟这种烈性传染病广泛的发生及流行,对养鹅业造成了巨大的威胁。小鹅瘟的防制主要依赖于弱毒疫苗或灭活疫苗的免疫接种[1],鹅群一旦感染后,各种药物治疗除了防止继发感染外,对改善病情无任何作用,惟一有效的治疗办法就是给感染鹅注射抗血清[2]。本研究研制出了小鹅瘟精制马源高免血清,取得了理想的防治效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 免疫用马 购自非疫区,经检查未见任何疫病的 3岁～8岁营养良好,健康马12匹,体重约250 kg～300 kg。购进后隔离饲养,驱虫,检疫。在隔离期间进行马传贫琼扩试验[3]和鼻疽菌素点眼试验,均为阴性者方可用于制造本品。

1.1.2 试验用雏鹅 1日龄雏鹅,购自吉林省农业科学院畜牧分院,不含小鹅瘟母源抗体,也未接种小鹅瘟疫苗的健康雏鹅。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原

1.2.1.1 水剂抗原 采用JLDA株,接种11日龄鸭胚,37.5℃条件下孵育,收集72 h～144 h之间死亡鸭胚胚液(羊水+尿囊液)。经细菌检验为阴性,滴度在10-5ELD50/0.2 mL以上者,作为免疫用水剂抗原,置冰箱内冷冻保存[4-6]。

1.2.1.2 油乳剂抗原 将浓缩的水剂抗原,经40 mL/L甲醛灭活后与油乳剂(97 mL白油,3 mL司班-80,2 g硬脂酸铝,加热溶解后 120℃高压30 min后使用)按1∶1比例,进行高速搅拌制成油乳剂灭活抗原[7]。

1.2.2 免疫程序

1.2.2.1 基础免疫 经检验合格的马匹,即可进行基础免疫;注射抗原3次,分别间隔10 d注射油乳剂灭活抗原25 mL/匹,注射部位以颈、肩部及身驱两侧为主,轮换注射,每个注射点的每次注射剂量不宜过多。

1.2.2.2 强化免疫 用浓缩的水剂抗原按25 mL/匹,皮下或肌肉注射,免疫后第15天采血,用琼脂扩散试验(AGP)测定效价。

1.2.3 血清抗体效价检测 采用琼脂免疫双扩法,制备10 g/L生理盐水琼脂板,琼脂板上打梅花形孔,孔径为5 mm,孔距为3 mm,中间孔滴加小鹅瘟琼扩抗原,周围孔分别加被检血清,同时设标准阴、阳性血清对照,放入湿盒内,37℃放置24 h～48 h观察结果[8-9]。

1.2.4 采血 当免疫马的小鹅瘟抗体效价达到标准后,开始从颈静脉采血。局部彻底消毒,在无菌的条件下采血,采血量按17 mL/kg～19 mL/kg计算。10 000 r/min离心 10 min,抽取上清,同时加入50 mg氯仿或30 mg硫柳汞,加塞密封充分摇匀,每瓶血清应作详细记载[10]。

1.2.5 抗小鹅瘟血清的精制 将要精制的血清混合于同一容器内,按血清量的2倍加入蒸馏水,充分搅拌均匀,用2 mol/L NaOH调整pH为3.5±0.1,然后按6 IU/mL～9 IU/mL加入胃蛋白酶和2 g/L甲苯,在29℃～31℃中消化2 h～24 h,消化期间要经常搅拌。消化完毕的溶液按150 g/L加入硫酸铵,溶解后用2 mol/L NaOH调整pH为4.6±0.1,然后用水浴方法加温,使之达到57℃±1℃保持30 min,待溶液冷却至43℃以下时,用帆布滤过,沉淀废弃。收集的上清液盛于同一容器内,用2 mol/L NaOH 调整pH为 7.2±0.1后,加入1.2 mol/L的硫酸铵,充分搅拌使之溶解,然后用帆布滤过,清液废弃。收集沉淀称重,按量加入5倍～6倍蒸馏水,溶解后,按总量加入100 g/L的明矾溶液使明矾含量为10 g/L,用2 mol/L NaOH调整pH为7.7～7.8,静置2 h～4 h使之沉淀。然后用帆布滤过,沉淀经水洗压干后废弃。将透明清液混合于同一容器中,按量加入1.2 mol/L硫酸铵,经搅拌溶解后用帆布过滤,上清废弃,沉淀压干后用透析袋分袋包装。每包约200 g～250 g加少许氯仿,放置在流水槽进行透析48 h～72 h。收集袋内血清,按量加入5 g/L氯仿、9 g/L氯化钠和30 mg硫柳汞,充分摇匀,溶解后用蔡氏澄清滤板滤过一次,滤液即为抗小鹅瘟血清。然后于5℃～15℃静置沉淀。抗血清在静置时期,每批抽取样品作效价测定、无菌检验和安全性检验,合格者进行分装[11]。

1.2.6 抗血清的检验

1.2.6.1 无菌检验 按生物制品无菌检验常规法进行,取1 mL抗血清,接种于马丁肉汤和鲜血琼脂培养基上,37℃培养48 h,观察细菌生长情况。

1.2.6.2 安全检验 抗血清批次分别是090123,090212,090316,经检验抗体效价为1∶32～1∶64。1日龄易感鹅雏40只,生长发育良好,无小鹅瘟相应抗体,适应观察2日进行试验,在接种前核实鹅的全身状况和临床疾病情况。所有的鹅均健康,没有任何鹅被排除在本试验外。随机均分为4组,即3个试验组和1个对照组,试验组分别用 090123,090212,090316批次的抗血清接种,接种剂量为0.5 mL/只,皮下或肌肉注射。观察20 d,内容包括精神状态、饮食欲、体温等,记录试验结果[12]。

1.2.6.3 抗血清对雏鹅的保护试验 强毒抗血清混合液:取0.1 mL小鹅瘟强毒液,加入0.9 mL的抗血清,置37℃水浴箱内感作2 h,即得所需。

强毒稀释液:取0.1 mL小鹅瘟强毒液,加入0.9 mL的无菌生理盐水,即得所需。

3日龄试验用鹅雏60只,随机均分6组,每批次抗血清2组,每组10只。第1组为试验组,第2组为对照。试验组用0.5 mL/只剂量接种强毒抗血清混合液1次,皮下注射;对照组用0.2 mL/只剂量接种强毒稀释液,皮下注射1次。观察饲养15 d,记录结果。

1.2.6.4 保存期测定 将制备的抗血清随机选取三个批次,每一批次的血清均保留3份,放置于4℃～8 ℃环境中保存,保存3个月、6个月、12个月、18个月、24个月。保存前后分别测其抗体效价,检测方法选用AGP法。

1.2.6.5 临床最佳预防剂量测定 将试验雏鹅160只随机均分4组,每组 40只。第 1组、第 2组、第3组均为试验组,第4组为对照。试验1组预防剂量用0.25 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;试验2组预防剂量用0.5 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;试验3组预防剂量用1 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;对照组不接种抗血清。5 d后分别使用JLDA株强毒攻击,攻毒后观察饲养20 d,记录结果。

1.2.6.6 被动免疫保护期的测定试验 3日龄试验用鹅雏180只,临床检查健康,用0.5 mL/只剂量抗血清接种120只3日龄试验雏,之后随机均分6个试验组,每组20只。试验组分别于接种抗血清后第 3 天、第 5 天 、第 7 天、第 10 天 、第 12 天、第 15 天等时间用JLDA株强毒攻击;对照组60只不接种抗血清,在各试验组攻毒时同时攻毒,每次5只。攻毒后隔离观察饲养15 d,记录试验结果。

1.2.6.7 临床最佳治疗剂量测定试验 用JLDA株强毒10-6ELD50/0.2 mL接种130只3日龄试验鹅,之后随机均分4个试验组,前3组为试验组。每组40只,于第3天发病时开始应用抗血清。试验1组治疗剂量用0.5 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;试验2组治疗剂量用1.0 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;试验3组治疗剂量用2.0 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;对照组10只不接种抗血清。记录试验结果。

1.2.6.8 区域应用试验 将生产的3批次抗血清产品,批号为090123,090212,090316。用于预防雏鸡最终效价稀释为32×,治疗雏鸡最终效价稀释为64×并按规程进行检验合格,应用于长春、白城、松原、吉林、四平、辽源等地养鹅户雏鹅。预防雏鹅524 800只,治疗感染小鹅瘟发病雏鹅56 600只。对部分预防和治疗雏鹅跟踪随访,统计防治效果。

2 结果

2.1 抗血清检验结果

2.1.1 无菌检验结果 制备的高免血清在马丁肉汤和鲜血琼脂培养基上,37℃培养48 h,观察未见细菌生长。肉汤清亮,镜检无菌。

2.1.2 安全检验结果 各组的试验并没有影响试验雏鹅的精神状态和饮食欲,全部健康成活,无手感体温变化。剖检部分试验雏,注射部位吸收良好,无硬结、肿胀、溃烂等肉眼可见的外观病理变化,各组织器官均无眼观病理变化。

2.1.3 雏鹅保护试验 试验组全部存活;对照组全部死亡。

2.1.4 琼脂双扩散试验 随即抽取抗血清批号为090123,090212,090316,用标准抗原和阳性血清对其抗体检测,结果表明抗小鹅瘟血清与小鹅瘟琼扩抗原在24 h内出现清晰的沉淀线,效价分别为1∶32、1∶32和1∶64。

2.1.6 保存期测定结果 在4℃～8℃环境中保存,保存18个月其抗体效价没有降低,证明抗血清在2℃～8℃条件下至少可保存18个月。

2.1.7 最佳预防剂量测定结果 接种抗血清后第5天用强毒攻击,0.25 mL/只剂量组抗血清预防保护率为75%。0.5 mL/只和1.0 mL/只剂量组抗血清预防保护率均为100%。对照组全部死亡。0.5 mL/只剂量组可以作为临床预防最小免疫剂量。

2.1.8 被动免疫保护期的测定结果 试验雏鹅于注射抗血清后不同时间攻毒,第3、5、7 d攻毒各组0/20(死亡/存活),保护率为100%,对照组10/0(死亡/存活),保护率为0;第10 d组2/18(死亡/存活),保护率为 90%;对照组10/0(死亡/存活);第12和15天组保护率下降为75%～50%。剖检对照组死亡鹅雏,有小鹅瘟典型病变。根据试验结果,抗血清被动免疫保护期为7 d～10 d。

2.1.9 治疗最佳剂量测定结果 试验 1组0.5 mL/只死亡 15只,治愈 25只,治愈率为62.5%,治疗效果较差。试验2组1.0 mL/只治愈率为95%(38/40);试验3组 2.0 mL/只治愈100%(40/40);对照组10只全部发病,临床上呈现典型的小鹅瘟症状,在7 d内陆续死亡,死亡数为10/10。剖检死雏均具有典型的小鹅瘟病特征性病理变化。故一次使用1.0 mL/只抗血清可作为临床最佳治疗剂量,治愈率为95%,对临床症状较重和病程较长的雏鹅可增加使用剂量或间隔1日再注射一次抗血清。

2.1.10 区域应用试验结果 在吉林省部分地区进行了抗血清的田间扩大试验,用于预防雏鹅524 800只,使用剂量为0.5 mL/只,预防保护率为95.57%;治疗雏鹅 56 600只,使用剂量为 1 mL/只～3 mL/只,早期治愈率为92.87%。

3 小结

通过抗体检测和临床应用结果表明,利用马制备精制抗小鹅瘟血清是可行的。结果表明,马源精制抗血清对初生雏鹅,用4倍量,试验雏鹅无不良反应。抗血清注入雏鹅体内,马上产生抵抗小鹅瘟病毒的可靠的免疫能力,起到被动免疫作用,皮下注射0.5 mL/羽,保护期达7 d～10 d,其保护率可达95.58%;对发病雏鹅群进行早期治疗,皮下注射1 mL/只～3 mL/只,其治愈可达92.87%。该抗血清具有保护率、治愈率高,保存期长的特点。抗血清于4℃～8℃可保存18个月。区域试验证明,本产品使用简便、易于推广应用。

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Preparation and Application of Hyperimmune Serum Against Goose Parvovirus from Horse

LI Lin,SHAO Hong-ze,REN Ke-yan,MAO Wen-zhi,XU Zhi-lin,YAO Xin-hua

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science of Jilin,Changchun,J iLin,130062,China)

Hyperimmune serum against JLDA strain of goose parvovirus was obtained from horses.52.48 million goslings were immunized for prevention by injecting 0.5 mL of the hyperimmune serum per goose,and 5.66 million infected goslings were injected 1 mL-3 mL per goose for treatment.The protection rate was 95.58%,and the cure rate was 92.87%.The results showed that the hyperimmune serum is a highly effective and safe agent.Hyperimmune serum obtained from horses not only could effectively avoid the homologous animals being infected with other epidemic pathogens,but also could bring much ecnomic benefit,compared with hyperimmune serum from the goose.

Gosling plague;Goose parvovirus virus;hyperimmune serum from horse;preparation;application

S858.33

B

1007-5038(2010)09-0115-04*

2010-02-06

李 琳(1979-),男,吉林长春人,助理研究员,硕士,主要从事动物传染病的诊断和防治的研究。