禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展*

邓小芸,祁小乐,高玉龙,高宏雷,秦立廷,王永强,王笑梅*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 禽传染病研究室,黑龙江哈尔滨 150001;2.东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨 150030;3.黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江双城 150111)

禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展*

邓小芸1,2,3,祁小乐1,高玉龙1,高宏雷1,秦立廷1,王永强1,王笑梅1*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 禽传染病研究室,黑龙江哈尔滨 150001;2.东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨 150030;3.黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江双城 150111)

禽网状内皮组织增生症(RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,国内外鸡群中网状内皮组织增生症病毒(REV)流行比较严重;REV与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中均普遍存在,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV可以整合到MDV和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染,并可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体;基于REV传统检测方法的基础上,新型的分子生物学检测技术如PCR、实时荧光PCR、LAMP提高了诊断REV的敏感性和特异性。

禽网状内皮组织增生症;流行;感染;基因重组;检测技术

*通讯作者

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其他禽类的,以急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征、淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合征[1]。REV病毒群可分为完全复制型和不完全复制型(缺陷型),不完全复制型T株基因组主要是由于gag-pol基因的大段缺失和env部分缺失所致,其含有1个0.8 kb～0.9 kb具有转化作用的替代片段V-rel基因,复制需要一个辅助病毒即完全T株REV-A。REV分离株存在以下亚型:网状内皮组织增殖病病毒(REV)、脾坏死病毒(Spleen necrosis virus,SNV)和鸭传染性贫血病毒(Duck infectious anaemia virus,DIAV)以及鸡合胞体病毒(Chick syncytia virus,CSV)。目前已分离到的REV都具有相似的抗原性,只有一个血清型[2]。

REV感染不仅能引起肿瘤,还可引起感染鸡胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩,使鸡的免疫功能下降、甚至丧失,导致免疫抑制,使感染鸡极易继发感染其他病毒病和细菌病。在我国,REV感染及在鸡群中造成的危害已相当普遍并且愈发严重。

1 流行现状

REV感染的自然宿主有火鸡、鸡、鸭、鹅和日本鹤鹑,该病呈世界性分布。鸡和鸡胚是最常用的试验宿主。REV有些毒株对鸭的致病作用比鸡更强。REV不仅造成免疫抑制,引起急性肿瘤。研究表明,REV也可以导致腺胃肿瘤病变并表现为腺胃肿大,与马立克病病毒(Marek＇s disease virus,MDV)协同或与鸡贫血病病毒(Chicken anemia virus,CAV)协同作用腺胃肿大症状就更加明显[3]。近年,世界各地不断有REV流行的报道。调查表明,韩国[4]和埃及[5]有34%～75%的鸡群有 REV抗体。在台湾,2006年对某一鸡群进行抗体检测和病毒分离,结果表明16周龄以上鸡群的血清中REV抗体阳性率达92.8%(39/42)[6]。在雅典,2006年通过病毒分离和PCR方法测得血液或肿瘤样品中REV阳性率为59.5%(28/47),组织中有淋巴肉瘤率为37%(10/27)[7]。

在中国,20世纪 80年代REV感染仅偶见报道。近年来,国内一些鸡群中REV流行也比较严重。崔治中等[8]对来自全国从南到北5省市9个公司100个鸡群的约2 400份血清样品的ELISA检测表明,有60%以上的鸡群在不同时期感染过 REV,不同地区不同鸡群的REV抗体阳性率从0到100%不等,平均约为20%;张洪海[9]结合血清学检测(主要通过琼脂扩散试验、ELISA)、免疫组织化学和PCR检测方法对山东省境内4周龄以上的AA种鸡进行检测,REV平均抗体阳性率分别为40.36%;倪楠[10]用nested-PCR从山东省121份鸭的组织DNA中检出 REV特异性核酸,阳性率为55%,这说明当地已有相当部分的鸭群感染或感染过REV。对上述样品同时进行细胞培养分离病毒、点杂交和常规PCR检测,但均为阴性。说明 REV在感染鸭体内病毒含量很低,或前病毒DNA与鸭基因组发生整合的机率比鸡低。2009年哈尔滨免疫抑制病实验室从宁夏、湖北、广东、辽宁、吉林39个蛋鸡场收集样品184份,测得5个省样品均存在不同程度的 REV感染,样品阳性率为 11.5%～84.6%,平均阳性率为19.0%[11]。

2 混合感染情况

REV、MDV、CAV和ALV-J等是养禽业中最常见的几种免疫抑制性病毒,在我国部分养鸡场中均普遍存在,这些病毒在生产鸡群中的混合感染是导致当前养禽业生产性能下降的重要因素之一,并且两种或两种以上病毒同时或先后感染某一个体时,则会相应增强各自的致病性,加重免疫抑制状态。

1999年-2007年,崔志中等[12]从疑似患J亚群禽白血病鸡群中,分离到27株ALV-J,其中有12株同时有REV共感染;2000年-2005年,从疑似患MDV肿瘤的鸡群中,分离到11株MDV野毒株,有6株同时有REV共感染;并且REV和ALV-J对于地方鸡来说已成为地方病,可以通过水平和垂直传播,病毒也可感染某些商品鸡、种鸡和蛋鸡,很难彻底消灭[13]。另外,2009年哈尔滨兽医研究所免疫抑制病实验室对宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江39个蛋鸡场184份样品检测结果表明,REV与ALV-J的混合感染率为13.6%(25/184)[11]。

张洪海[9]对山东省境内57份活鸡进行剖检取样,通过病理组织学观察和免疫组织化学检测结果表明,发病鸡在肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、骨髓等组织内存在 REV、ALV-J或 MDV抗原的阳性信号。REV+MDV双重阳性率为5.26%;REV+ALV-J双重阳性率为8.77%;MDV+ALV-J+REV三重阳性率为3.51%。PCR检测结果表明REV+MDV双重阳性率为10.53%,REV+ALV-J双重阳性率为12.28%,MDV+ALV-J+REV三重阳性率为7.02%。

3 基因组的整合

REV以重组的形式污染MDV[14]和FPV[15-16]基因组的现象比较普遍。只有插入到病毒基因组中的REV前病毒序列接近完整时才可能造成危害[15]。Liu Q 等[15]从 FPV疫苗中分离出两株REV,并测定其全基因组序列。Hertig C等[16]详细研究了REV在禽痘病毒(Fow l poxvirus,FPV)中的整合位置。Singh P等[17]分离了一株整合到FPV的几乎完整的REV前病毒cDNA。Zhang Z等[18]在国内外首先从肿瘤病鸡中分离到整合有REV LTR的MDV天然重组野毒株,而且丁家波等[19-20]还证明了从国内收集到FPV弱毒疫苗及野毒株都带有REV LT R。整合REV前病毒的FPV仍能够有效的抵御 FPV[21];截掉整合到 MDV的 REV LTR后,就会降低马立克病毒的致病作用,但能增强其水平传播能力[22]。因此,整合REV可导致这些病毒遗传发生变异,从而加快这些病毒的致病性及抗原性变异,REV的这种流行病学上的潜在危害,更是不能忽视。

REV作为反转录病毒的成员,在其生命周期中可以整合到宿主细胞的基因组中,因此REV可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体[23],这类载体在转基因鸡和人的基因治疗方面有很大用途。因此,可以利用该重组质粒并对之进行改造,使之发展成为一种病毒载体,在基因治疗等方面发挥作用。

4 检测技术

4.1 传统检测方法

尽管国内外先后建立起了 REV琼脂免疫扩散试验、间接免疫荧光抗体试验、间接ELISA方法以及ABC-ELISA等方法检测REV抗体。但是当抗体水平极低时,容易造成假阴性的判断,因此确诊需进行病原检测。病毒分离培养是最经典、最准确的检测方法。采集病料,进行研磨、分离上清液、过滤除菌后,接种鸡胚成纤维细胞(CEF)单层,吸附2 h,加入含有10 mL/L犊牛血清的培养基,培养7 d。然后再消化和传代一次,继续培养7 d,电镜下观察病毒粒子的形态。同时将样品消化传代至96孔细胞培养板中,培养7 d,用REV特异性抗血清做免疫荧光试验(IFA),这一过程至少需要数10 d,耗时太长灵敏性也不够。另外,取患病禽的组织器官,制成组织切片,REV囊膜糖蛋白单克隆抗体作为一抗,加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗,细胞浆内有绿色荧光染色者,则判为阳性,从而建立了可以直接从组织切片中检测 REV的免疫荧光技术[24]。此方法能够清晰地显现出 REV抗原的存在、位置及组织病理变化,检测时间短,检出率高,可以直接对病毒抗原进行定位,但是不适合大量检测。

4.2 分子生物学检测方法

近几年随着分子生物学技术的发展,REV的诊断技术也有了很大进步,首先 PCR技术应用到REV检测中。该方法基于 REV前病毒DNA可插入到宿主DNA中,故直接使用组织DNA扩增出目的片段。REV的LT R较稳定,可扩增出约300 bp的序列[25]。此后,又相继设计了来自REV基因组env、gag区的脱氧核苷酸引物[25],利用PCR技术检测REV。PCR技术具有快速、准确、特异性和敏感性强的特点,可以检测出带毒而未出现临床症状的鸡只,确定早期感染。可以作为REV流行病学调查的一种方法,应用范围广,同时亦可作为REV确诊的一种手段,进行大批量检测。

基于 Light Cycler平台,利用 SYBR GreenI染料能特异性与双链DNA结合而发荧光的特性,建立了一种荧光PCR方法检测REV。以前病毒基因组DNA模板,荧光定量PCR可以使PCR扩增和产物分析的全部过程都在单管封闭条件下进行,并通过微机控制,实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果,减少了PCR扩增产物的污染[26]。宋丽等[27]根据LT R保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法(Real-time PCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其他病原出现交叉反应;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为 REV序列。SYBR Green I实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。

哈尔滨兽医研究所免疫抑制病课题组实验室又建立了针对pol基因的快速诊断REV的LAMP方法(即环介导等温扩增法),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环及特殊的仪器设备,只需一个简单的恒温器,适合疫区现地检测。结果判定:①加入SYBR GreenⅠ荧光染料,观察 LAMP反应液是否发生颜色变化,再将PCR反应管置于紫外灯下照射,观察是否有强烈的荧光产生;②副产物-焦磷酸镁的浊度检测具有极高的特异性,只要用肉眼观察或浊度仪下,阳性的PCR反应管中有白色沉淀;(3)电泳,将扩增产物跑电泳后在紫外灯下观察可见扩增产物呈梯状条带。其敏感性至少是PCR的25倍,特异性也很好,而且简单易操作,有望成为未来检测REV的得力工具。

5 展望

禽网状内皮组织增生症是禽类重要的致瘤性和免疫抑制性疾病之一。然而,由于临床症状不典型,该病长期以来没有得到足够的重视。近些年来,该病在全球迅速蔓延,我国的阳性率也逐步升高,对养禽业的直接和间接的危害日趋严重。免疫抑制、致肿瘤、混合感染、污染疫苗、基因组重组使人们对REV重要性的认识得到了逐步加强。

混合感染,特别是REV与其他免疫抑制病的混合感染,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。而且,REV容易以重组的方式污染其他疫苗株,进而感染免疫鸡群。另外,非SPF鸡胚生产的禽类弱毒疫苗也是该病得以蔓延的重要原因之一。

REV的危害不仅仅在于其自身,而且间接地影响到疫病的综合防控。为了预防REV感染,一是应严格杜绝弱毒疫苗污染REV,制备活疫苗的鸡胚必须严格保证是SPF鸡胚,尤其是MDV和FPV苗,及其他鸡胚来源的弱毒疫苗;二是净化种鸡群,对种鸡群进行检测,剔除阳性鸡,从源头上阻断该病毒的传播;三是将分子生物学技术和传统检测手段很好的结合,更有效的确诊REV,加强其流行病学调查,为综合防控提供必要的参考;四是研究开发REV疫苗,免疫种鸡,通过母源抗体预防垂直传播和早期感染;五是深入开展REV的基因功能研究,研究REV的致瘤和免疫抑制机制。

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Progress on Epidemiology and Detection Technique of Reticuloendotheliosis

DENG Xiao-yun1,2,3,QI Xiao-le1,GAO Yu-long1,GAO Hong-lei1,QIN Li-ting1,WANG Yong-qiang1,WANG Xiao-mei1

(1.Division of Avian In fectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute of CAAS,Harbin,Heilongjiang,150001,China;
2.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongj iang,150030,China;
3.Vocational College of HeiLongjiang Animal Husbandry and Veterinary Science,Shuangcheng,Heilongjiang,150111,China)

Reticuloendotheliosis is an oncogenic and immunosuppressive disease for avian.Recently,REV is prevailing in avian in the world.Mixed infections with MDV,CAV and ALV-J exist in poultry in our country,which make chicken hypoimmunity and immune failure after injecting AIV and NDV vaccines,and may cause secondary infection.So it is very difficult to diagnose and control REV.Otherwise,REV can integrate into the Marek＇s disease virus(MDV)and fowl poxvirus(FPV)genome,which contaminate commercial vaccines and it can contain exogenous genes insert in cell of chicken and mammal.Based on the traditional detection technique,new molecular biology skills,for example,PCR,real-time PCR,LAMP,elevate the sensitivity and specificity in diagnosing REV.

Reticuloendotheliosis;epidemiology;infection;genome recombination;detection technique

S856.5

A

1007-5038(2010)09-0093-04

2010-03-22

现代农业产业技术体系建设专项基金(nycytx-42-G3-01);公益性行业(农业)科研专项基金(200803020-03)

邓小芸(1980-),女,内蒙古巴彦淖尔人,博士研究生,讲师,主要从事分子病毒学研究。