肺部马尔尼菲青霉菌感染动物模型制作

梁 义,尹 琦,陈 勇

(广西柳州市柳铁中心医院皮肤科 545007)

随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和抗肿瘤化疗药物等的广泛应用,以及器官移植的广泛开展,近年来侵袭性马尔尼菲青霉菌感染(PSM)发病率和病死率逐年升高。肺脏是PSM最常见的感染部位[1],常规诊断方法存在许多局限性或敏感性、特异性低,或时效性差或标本取材困难[2],亟待建立更为可靠﹑快速的诊断方法。血浆马尔尼菲青霉菌细胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖检测已成为目前倍受关注的侵袭性马尔尼菲青霉菌感染诊断方法[3]。本研究通过制作肺部马尔尼菲青霉菌感染动物模型,为以后检测血浆中1,3-β-D-葡聚糖水平并评价其在肺部马尔尼菲青霉菌感染中的诊断价值,为临床上推广应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 实验用马尔尼菲青霉菌由本院微生物室提供。

1.2 实验动物 清洁级健康成年SD新西兰大白兔,重约1 000～1 500g,雌雄不限,共75只,由广西医科大学实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 将75只新西兰大白兔随机分成3个组,每组25只,分别为肺部马尔尼菲青霉菌感染免疫抑制组(A组)、免疫抑制健康组(B组)、肺部马尔尼菲青霉菌感染健康组(C组)。

1.3.2 肺部感染动物模型制作 (1)真菌感染动物模型:用生理盐水将在37℃培养、生长旺盛的马尔尼菲青霉菌配制成1×109cfu/mL混悬液,将新西兰大白兔给予氯胺酮(100mg/kg,腹腔注射)麻醉、固定后,用自制气管插管分别插入A组和C组新西兰大白兔气管内,将马尔尼菲青霉菌混悬液分别注入A组和C组的新西兰大白兔气管内,按106cfu/g每次注入混悬液0.5～1.0mL,1次/天,连续3d。接种前3d开始肌内注射环孢霉素A,给予A组和B组的每只新西兰大白兔环孢霉素A 5.0mg/(kg◦d),直至接种结束。(2)B组新西兰大白兔只给予同量的环孢霉素A肌肉注射后,不作任何其他处理。接种完成后每天观察各组新西兰大白兔的精神状态、活动、饮食及一般状况。接种后头3d各组新西兰大白兔未出现明显异常。第7、8天时,4只A组的新西兰大白兔出现精神萎靡、活动进食减少现象。第9天A组的新西兰大白兔全部发病。而B组和C组的新西兰大白兔均未出现明显异常表现。于接种后第9天以无菌操作采取各组新西兰大白兔血标本和肺组织标本,采血方法均经心脏穿刺取血4～5mL,经心脏穿刺新西兰大白兔死亡后统一取新西兰大白兔右肺组织。各组血标本均以无菌抗凝管收集,分别留取A组、B组和C组的每只新西兰大白兔的血标本2～3 mL送本院微生物室以葡萄糖蛋白胨琼脂培养基做真菌培养。

2 结 果

各组模型动物肺组织病理结果:(1)A组,25只新西兰大白兔中,有25只的肺组织中发现马尔尼菲青霉菌菌丝、孢子。肺组织均见程度不等的中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润及坏死灶形成;并有组织细胞肉芽肿形成,肉芽肿可扩大融合,中央坏死和白细胞反应形成脓肿,脓肿壁由组织细胞构成,膨胀的组织细胞内有大量酵母繁殖。酵母圆形、椭圆形、腊肠形、马蹄形。HE染色酵母胞膜、胞浆不着色,致使淡蓝色的核周围有一空晕。PAS染色阳性。Grocotts染色阳性,菌体内横隔着色深于胞膜,故长形、马蹄形菌体可见横隔,于横隔处裂殖[4-5]。(2)B组和C组新西兰大白兔的肺组织HE染色光镜下呈现正常肺组织结构,未见有明显炎症病理改变。所有新西兰大白兔血真菌培养结果均为阴性。

3 讨 论

马尔尼菲青霉菌为肺部真菌感染的致病菌,且为条件致病菌,即宿主一般要有免疫缺陷等宿主因素才能致病。本研究中肺部感染免疫抑制模型的制作,是通过给予新西兰大白兔环孢霉素A造成宿主的免疫抑制,并通过气管插管方法将马尔尼菲青霉菌注入新西兰大白兔气管内,使其更容易被侵袭到肺部而导致肺组织的真菌感染,接种马尔尼菲青霉菌后的免疫抑制新西兰大白兔于第9天全部出现精神萎靡、进食减少等症状,肺组织病理学发现马尔尼菲青霉菌菌丝和孢子的侵入,并伴有相应的炎症病理改变,由此可确定肺部马尔尼菲青霉菌感染模型制作成功。对于灌注菌量的选择,本研究在参考了刘栋华等[1]、吴易等[2]、梁伶等[6]的研究数据(灌注菌量为 105cfu/g)后,根据本研究的目的和实验动物特点,选择的灌注菌量为106cfu/g,成功地制作了肺部马尔尼菲青霉菌感染模型。证明在免疫抑制条件下,本研究选择的灌注菌量106cfu/g,能100%(25/25)导致新西兰大白兔肺部感染马尔尼菲青霉菌。该结果从侧面印证了临床上马尔尼菲青霉菌病主要发生于免疫抑制患者的肺部[1-2]。

关于马尔尼菲青霉菌病动物模型的制作传统方法有静脉接种和腹腔内接种等,而本研究中采用的气管内接种法较少见,气管内接种途径对肺部感染的制作更有意义。气管内马尔尼菲青霉菌接种法可以成功模仿肺部马尔尼菲青霉菌感染模型,展现了实验性马尔尼菲青霉菌病的自然演变过程,为马尔尼菲青霉菌病基础研究的进展奠定了基础,同时对更加深入地研究马尔尼菲青霉菌病的预防、诊断和治疗具有一定的应用价值。

[1]刘栋华,谭升顺,梁伶,等.经皮肤损伤感染马尔尼菲青霉菌致病力动物实验研究[J].中国皮肤性病学杂志,2006,20(6):324.

[2]吴易,梁伶,李菊裳.广西银星竹鼠与人马尔尼菲青霉病关系的研究[J].中国皮肤性病学杂志,2004,18(4):196.

[3]Yoshida M,Roth RI,Grunfeld C,et al.Soluble 1,3-β-D-glucan purified fromCandida albicans:biologic effects and distribution in blood and organs in rabbits[J].Lab Clin Med,2000,128(1):103.

[4]黄长武,李兴禄,黄艺,等.马尔尼菲青霉菌的鉴定[J].微生物学杂志,2006,26(1):61.

[5]陈姝,娄世锋,黄长武,等.马尔尼菲青霉菌病1例报告并文献复习[J].重庆医学,2005,34(4):637.

[6]梁伶,成先桂,刘栋华,等.马尔尼菲青霉菌野生株和临床分离株致病力研究[J].中国人兽共患病学报,2008,24(3):240.