细胞生长因子诱导骨髓基质干细胞成骨的研究进展

刘道华综述,夏德林审校

(泸州医学院附属口腔医院口腔颌面外科,四川泸州646000)

骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)被认为是骨组织工程中最有应用前景的理想种子细胞[1]。由于BMSCs具有分化多方向性的特点,而骨组织工程学要求其向单一方向分化,所以,BMSCs的定向诱导具有重要作用。就其成骨方向来说,常用的具有诱导作用生长因子有骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等。它们不仅可单独作用,相互之间也存在着密切的关系,可复合使用。本文就细胞生长因子对BMSCs分化及增殖的诱导作用作一综述。

1 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一组疏水性的酸性糖蛋白,属于转换生长因子超家族。BM P是一组具有很强骨诱导活性的生长因子,可能是诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞系转化的基本信号因子,其中研究最多也是成骨活性最强的是BMP-2和BMP-7。BMP-2可明显加速BMSCs向成骨细胞转化,可促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞转化。研究表明,BM P首先与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体相结合,形成Ⅰ、Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的二聚体,然后将信息转导入细胞内,经第 2信使M AD(matheragainst dpp)的磷酸化,将信息导入细胞核内,从而激活或调整DNA的结合活性,使BMP活性相关的基因表达,产生相应的生物效应。

对BM P的骨诱导活性人们看法比较一致,其在体内通过募集间充质细胞,并诱导其向成骨细胞或成软骨细胞方向分化,同时协同其他调节因子共同参与诱导骨形成;在体外不仅能够调节成骨细胞的转化,对骨祖细胞以及间充质细胞均具有强烈的骨诱导活性,而且可能使诱导性骨细胞向确定性骨细胞转化。但其对细胞增殖的影响目前尚有争论。Akino等[2]用BMP-2及bFGF诱导人BMSC发现用BMP-2诱导的无血清培养的BMSC在2d时细胞数目显著增多并达到平台期,且BMP-2和bFGF有明显的协同作用二者合用可使平台期后延。用荧光激活分选术进一步表明BMP-2使细胞周期前移G2/M期细胞比例增多。研究证实,重组人BM P-2(rhBMP-2)能够提高人BM SC及肋骨来源的成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素、Ⅰ型胶原 mRNA的表达。Boden[3]以 LMP-1(潜在性膜蛋白-1)cDNA转染骨髓细胞,在脊柱融合模型中局部植入可诱导实验组100%脊柱融合,而对照组未见成骨。有研究表明用地塞米松处理成纤维样的骨髓基质细胞向成骨细胞分化时表达BMP-2,而ascorbic acid作用于骨髓基质细胞时,发现它可通过诱导Ⅰ型胶原形成,继而激活包括BMPs的信号通路,促进骨基质细胞系ST2细胞的成骨性分化。用simvastatin作用于骨髓基质细胞可以增加osteocalcin mRNA的表达与碱性磷酸酶的活性,诱导 BMP-2的表达,促进成骨[4-5]。有学者运用分子生物学技术,将骨形态发生蛋白2基因转入细胞内,在表达载体的作用下,产生具有生物学活性的骨形态发生蛋白2二聚体,并分泌到细胞外,诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化,促进骨组织生成[6-9]。

2 成纤维细胞生成因子(fibroblast growth factor,FGF)

根据等电点的不同,将其分为酸性和碱性两种,广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨等多种组织细胞中,是一种广谱的有丝分裂源,对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用,不仅能够促进软骨及骨组织的形成,并且是一种强烈的毛细血管形成刺激剂[10],也是形态发生和分化的诱导因子,在正常生理和病理过程中参与生长发育和组织损伤修复过程。bFGF能够促进BMSCs体外培养成纤维细胞集落的形成,促进细胞的增殖,但对BMSCs的转化作用仍存在不同的研究结果。有研究证实在地塞米松存在的培养环境中,bFGF作用6d时可显著增加细胞增殖,同时骨钙蛋白表达、骨矿化结节形成。BMP-2的促转化作用不如bFGF明显,两者联合应用时促BM SCs转化作用强于单一因子。在众多生长因子中bFGF对BMSCs具有最强的促分裂作用,同时经bFGF作用的细胞植入体内表现出较强的成骨能力。

成纤维细胞生长因子18是新近克隆的成纤维细胞生长因子家族成员之一,已被证实是一种发育组织重要的分泌性信号分子,在骨骼和软骨的发育中发挥着重要的作用[11]。有文献报道骨髓基质干细胞表面表达有 FGF的受 体,对FGF有良好的反应,体外实验也发现,其对骨髓基质干细胞增殖和分化为成骨细胞的作用远强于BMP-2。有实验观察到FGF-2在体外可以促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化增殖,FGF-2处理骨髓基质细胞后可显著增加它们的增殖潜能以及子代细胞的数量与克隆的大小,提高非造血前体细胞与骨髓成纤维细胞表面分化抗原与碱性磷酸酶的表达,在加入地塞米松后可促进其进一步的成熟。

3 转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)

TGF-β是一族具有多种功能的蛋白多肽,相对分子质量100～250kd,广泛存在于人体组织中的生长因子,以骨和血小板中含量最高,参与人体许多组织的炎症和修复反应,是较强的促成骨分化的因子。

体外实验表明,TGF-β可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化,促进成骨和成软骨细胞的增殖,刺激Ⅱ型胶原、骨粘连蛋白和骨桥蛋白的合成。研究发现TGF能够抑制BMSCs的增殖,但能提高其成骨细胞ALP的表达,并能减少和延迟BMSCs向脂肪细胞的转化。基因重组人转化生长因子β可以诱导BMSCs向成骨细胞分化和成熟。有研究表明 TGF-β1和BMP在对基质干细胞向骨细胞方向分化的作用是不同的,TGF-β1在基质干细胞向成骨细胞分化的早期阶段起关键作用,而BM P则促进成骨前体细胞的存活和成熟。TGF-β对BMSC的作用与细胞分化程度有关,早期促进增殖晚期促进分化。TGF-β对多种细胞具有促分化效应,是较强的促成骨分化的因子。有研究发现TGF-β能够抑制BMSC增殖,但能提高其ALP的表达,并能减少和延迟BMSC向脂肪细胞转化,从而提高BMSC的成骨效应。

4 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)

VEGF是一种糖蛋白,其相对分子质量为 34～45kd,由两个相对分子质量各为17～22kd的不同亚单位组成的二聚体。人类VEGF基因位于染色体 6P12,全长 14kb,由 8个外显子和7个内含子组成。由于VEGF mRNA有不同的剪接方式,所产生的VEGF蛋白主要有5种亚型,近年来研究表明,血管内皮生长因子对中胚层细胞分化有作用,可以使骨髓基质干细胞向成骨分化。有研究发现,外源性VEGF能使体外培养的成骨细胞ALP活性及cAM P浓度提高4倍。VEGF诱导成骨细胞迁移,增加ALP活性,同时成骨细胞自身合成VEGF。PGE1,PGE2,1、25(OH)维生素D3及IGF2Ⅰ能增加成骨细胞VEGF mRNA的表达。

通过对外源性血管内皮细胞生长因子修复鼠下颌骨缺损进行组织学观察,发现血管内皮细胞生长因子组标本内血管形成明显增加,骨组织的再生也增加,证实了局部应用血管内皮细胞生长因子能促进骨组织再生[12]。近年来有研究证实血管内皮细胞生长因子在血管再生中起着重要作用。它通过促进血管内皮细胞的有丝分裂、血管通透性的增加及增进单核细胞的趋化性等促进血管的再生。血管内皮细胞生长因子不仅能促进血管的再生,而且能调节成骨细胞的成骨活性,使其能更好地分泌细胞外基质,从而促进成骨。

5 胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF-1)

IGF-1是由70个氨基酸组成的单链多肽,相对分子质量7.7kd,由3个二硫键交叉连接,被认为是软骨细胞合成代谢的主要促生长因子。IGF-1通过与IGFBPs(IGF-binding protein)相互作用来调节其生物学功能。IGF-1可刺激单层培养中人软骨细胞的增殖,且与其剂量呈正相关。Kellner等[13]在实验中发现IGF-1在体外软骨组织工程中具有显著的正面效应。而胰岛素也被证明能够与IGF-1的受体相结合,并产生相同的效应。他们在试验中将牛关节软骨细胞在多聚葡酸(PGA)支架上培养7周。结果显示体外胰岛(0.05～50mg/mL)能够促进组织工程软骨的生长速度及多聚葡酸的聚集,并能优化软骨形态,其中以2.5mg/mL的浓度时效应最为明显。IGF-1与透明质酸联合应用时具有显著的促进组织工程软骨细胞生长的作用[14]。IGF-1与bFGF或 TGF-β2的混合物也可明显促进组织工程软骨的发生以及Ⅱ型胶原的生长[15]。

6 基因修饰(gene-modified)

许多生长因子如 BM P-2、BMP-7、TGF-β、bFGF等不仅可通过人工基因重组产生,而且能以病毒或非病毒载体通过体外转移的方法导入BMSC内并有效表达,用来修复骨缺损取得了良好的效果。有学者利用腺病毒通过体外转移的方法将BMP-2基因导入骨髓基质细胞,然后将该骨髓细胞与脱矿骨基质复合后修复小鼠股骨缺损,术后2个月,24处骨缺损中有22处骨性愈合[16]。有学者比较了腺病毒、逆转录病毒、脂质体载体对转hBMP-2基因小鼠MSC修复颅骨缺损的效果差异,发现腺病毒组成骨效果最显著,脂质体组最少。研究表明将TGF-β1基因的复制缺陷型病毒转入成骨细胞中,转染后成骨细胞中TGF-β1mRNA的表达仍保持在明显的上调状态,细胞分泌合成的TGF-β1较对照组高 46倍,细胞Ⅰ型胶原含量提高了5倍,将转染了 TGF-β1的成骨细胞植入体内可明显增加新生骨组织的数量。基因修饰干细胞,可实现BMSC在体外长期扩增并维持某些干细胞的多向分化潜能特性,文献证实利用端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcrip tase,TERT)基因修饰的MSC体外连续传代培养3年后,仍保持良好的自我更新和多向分化潜能[17]。利用TERT基因修饰的MSCs建立种子细胞库有可能解决目前骨组织工程临床应用中种子细胞来源的难题,但其所致永生化细胞是否有致瘤性尚需进一步研究。实验采用局部基因治疗的方式,将携带有骨形态发生蛋白2真核表达载体导入机体特定部位的细胞内,通过实验证实其具有诱导异位成骨作用,并能有效促进兔桡骨缺损的修复[18]。

细胞生长因子通过调节BMSC增殖、分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程,随着基因技术的发展,对基因载体的研究日益受到研究者的重视。目前报道应用的基因载体有真核表达载体cDNA载体、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、猴空泡病毒(SV40)等。将编码特定生长因子的基因导入BM SC,使目的基因在细胞内表达并合成具有骨诱导作用的生长因子,从而克服了外源性生长因子在体内半衰期短、需反复给药、大剂量给药有不良反应等缺点,是骨组织工程的又一重要研究方向。

[1]Bonab M M,Alimoghaddam K,Talebian F,et al.Aging of mesenchymal stem cell in vitro[J].BMC Cell Biol,2006,7:14.

[2]Akino K,Mineta T,Fukui M,et al.Bone morphogenetic protein 2 regulates proliferation of human mesenchymal stem cells[J].Wound Repair Regen,2003,11(5):354.

[3]Boden SD.Biology of lumbar spine fusion and use of bone graft substitutes:present,future,and next generation[J].Tissue Eng,2000,6(4):383.

[4]Somg C,Darg G,Jia H,et al.Simvastatin induces estenhlastic diffeentiation of bonellmrnw stronal cells[J].Beijin Da Xue Xue Bao,2003,35(5):533.

[5]Song C,Guo Z,Mz Q,et al.Simvastatin induces esteoblastic differentiation and inhibits adipecytic differentiation in minse boneⅡmnDw stromal cells[J].Bioechem Biophys Res Commun,2003,308:458.

[6]Jiang S,Zhang S,Langenfeld J,et al.Mycoplasma infection transforms normal lung cells and induces bone morphogenetic protein 2 expression by post-transcriptional mechanisms[J].J Cell Biochem,2008,104(2):580.

[7]Vogt S,Ueblacker P,Geis C,et al.Efficient and stable gene transfer of growth factors into chondrogenic cells and primaryarticularchondrocytes usinga VSV.G pseudotyped retroviral vector[J].Biomaterials,2008,29(9):1242.

[8]Liu HW,Chen CH,Tsai CL,et al.Heterobifunctional poly(ethylene glycol)-tethered bone morphogenetic protein-2-stimulated bone marrow mesenchymal stromal cell differentiation and osteogenesis[J].Tissue Eng,2007,13(5):1113.

[9]Shirasawa S,Sekiya I,Sakaguchi Y,et al.In vitro chondrogenesis of human synovium-derived mesenchymal stem cells:optimal condition and comparison with bone marrow-derived cells[J].J Cell Biochem,2006,97(1):84.

[10]Simons M.Integrative signaling in angiogenesis[J].Mol Cell Biochem,2004,264(1-2):99.

[10]Bhindi R,Brieger D,Ishii H,et al.Fibroblast growth factor 2 and the transcription factor Egr-1 localise to endothelial cell microvascular channels in human coronary artery occlusion[J].Thromb Haemost,2005,93(1):172.

[11]Ohbayahi N,Shibayma M,Kuretaki Y,et al.FGFI 8 is required for normal cell proliferation and differentiation during osteogenesis a nd chondregenesis[J].Genes Dev,2002,16(7):870.

[12]Yamashima T,Yoshimura K,Morita O,et al.Histological study of bone regeneration using vascular endothelial growth factor on rat mandibular bone defect[J].Nihon Hotetsu Shika Gakkai Zasshi,2005,49(5):726.

[13]Kellner K,Schulz MB,Gopferich A,et al.Insulin in Tissue Engineering of Cartilage:A Potential Model System for Growth Factor Application[J].J Drug Targeting,2001,9(6):439.

[14]Huang JR,Liu SL,Song WD.Stimulation of insulin-like growth factor-I to chondrogenesis of engineering cartilage tissue[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2004,18(1):49.

[15]Chua KH,Aminuddin BS,Fuzina NH,et al.Interaction between insulin-like growth factor-1 with other growth factors in serum depleted culture medium for human cartilage engineering[J].Med J Malaysia,2004,59(Suppl B):7.

[16]Blum JS,Barry MA,Mikos AG,et al.In vivo evaluation of gene therapy vectors in ex vivo-derived marrow stromal cells for bone regeneration in a rat critical-size calvarial defect model[J].Hum Gene Ther,2003,14(18):1689.

[17]Abdallah BM,Haack-Sorrensen M,Burns JS,et al.Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene despite〔corrected〕 extensive proliferation[J].Biochem BiophyRes Commun,2005,326(3):527.

[18]Tian XB,Sun L,Yang SH,et al.Osteogenic potential of the human bone morphogenetic protein 2 gene activated nanobone putty[J].Chin Med J(Engl),2008,121(8):745.