氯霉素分子印迹聚合物微球的制备及色谱性能评价

史西志，杨 华，孙爱丽，李德祥，陈 炯

(1.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211；2.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100)

氯霉素分子印迹聚合物微球的制备及色谱性能评价

史西志1，杨 华2，孙爱丽1，李德祥1，陈 炯1

(1.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211；2.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100)

以氯霉素(CAP)为模板分子、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(DEAEM)为功能单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂、聚苯乙烯微球作为种球，采用两步溶胀聚合的方法制备得到了粒径均一的分子印迹聚合物微球(MIPMs)。结果表明：扫描电镜观察显示其表面为多孔结构；通过孔容和孔径研究表明，与非印迹聚合物微球(NIPMs)相比，MIPMs具有更大的孔径和孔体积；进一步通过液相色谱对其选择性能进行评价，可知氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素在MeCN/Water/H3PO4(30:70:0.1，V/V)流动相条件下，3种物质达到了较好的分离效果，获得的MIPMs对3种物质具有较好的选择性能。

氯霉素；分子印迹微球；甲砜霉素；氟甲砜霉素

氯霉素(chloramphenicol，CAP)对革兰氏阳性和阴性细菌均具有抑制作用，主要用于治疗各种细菌感染，但是由于其具有严重的毒副作用，如导致骨髓抑制(bone marrow depression)、再生障碍性贫血(aplastic anemia)、先天性发育不全(hypoplastic anemia)等[1]。因此，已被许多国家如中国、欧盟和美国等禁止在动物性食品中使用，并立法规定了最高残留限量[2]。目前，关于氯霉素的检测方法，主要有酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)[3]、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)[4]、气相色谱(gas chromatography，GC)[5]及液相色谱-串联质谱(liquid chromatographic-tandem mass spectrometri，LCMS/MS)[6]、气相色谱-串联质谱(gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS)[7]等，各种检测方法均需要高效的分离、纯化过程。分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是人工合成的对

某一或某类分子(模板分子及其类似物)具有特定选择性的聚合物，已成功应用于氯霉素等各类抗生素的分离纯化[8]。但是，目前，制备MIPs的方法主要是本体聚合法(bulk-polymerization)，该方法虽然制备简单，但是后续处理过程复杂，如需要经过研磨、筛分才能得到合适大小的粒子，得率较低[9]；因此，为了克服本体聚合方法的缺点，近年来，制备形状规则、粒径均一的MIPs的方法得到了快速发展，如悬浮聚合、多步溶胀聚合和沉淀聚合等[10]。本实验拟利用两步溶胀聚合的方法制备氯霉素特异的分子印迹聚合物微球(molecularly imprinted polymer microspheres，MIPMs)，并对其表面形态、孔容、孔径及选择性等性能进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟甲砜霉素(FF)德国Sigma公司；甲基丙烯酸、N,N-二乙基氨基乙酯(DEAEM) Sigma-Aldrich公司；二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、苯乙烯 Fluka公司；甲醇、乙腈(色谱纯) TEDIA公司；偶氮二异丁腈(AIBN)、氯仿、十二烷基硫酸钠、过硫酸钾、邻苯二甲酸酯等(分析纯)国药集团药业股份有限公司；聚乙烯醇1788 上海石油化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-10Avp高效液相色谱系统、Venusil XBP C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱 日本岛津公司；SIRION 200场发射扫描电子显微镜 美国FEI公司；BELSORP-mini IIINC测量设备 BEL公司。

1.3 实验条件

1.3.1 分子印迹微球的制备

MIPMs的制备主要参照Javanbakht等[11]报道的方法，并在此基础上进行了适当改进，其制备方法如下。

1.3.1.1 聚苯乙烯种球的制备

将15mL 苯乙烯、100mg 过硫酸钾加入到150mL 水中，置于四口瓶中，然后超声波处理10min，通入氮气5min，70℃，270r/min反应24h，反应过程中持续通入氮气。反应结束后，5000r/min离心收集种球，然后加入适量水，使种球与水配比为100mg/mL。

1.3.1.2 微球的制备

溶液Ⅰ：0.96mL邻苯二甲酸酯、0.02g十二烷基硫酸钠、10mL水，超声30min，然后加入1mL水分散聚苯乙烯种球，超声20min，室温，125r/min振荡，直到显微镜下油滴完全消失；溶液Ⅱ：0.3g AIBN，5mL氯仿，12.5mL水，10mL 4.8%聚乙烯醇1788，超声混合20min，125r/min室温振荡2h，使其分散均匀；溶液Ⅲ：12.5mL水，10mL 4.8%聚乙烯醇1788，0.32g CAP，0.8mL DEAEM，5mL EGDMA，0.02g十二烷基硫酸钠，2mL四氢呋喃，超声混合20min，125r/min室温2h。

将溶液Ⅰ、Ⅱ加入到溶液Ⅲ中，50℃氮气条件下反应24h；反应结束后，将微球置于200mL沸水中10min，5000r/min离心收集，然后将聚合物微球用甲醇-甲酸(V/V，90:10)索氏萃取24h，然后用甲醇萃取2h，最后将得到的聚合物微球50℃真空干燥6h至质量恒定。

对照聚合物微球(non-imprinted polymer microspheres，NIPMs)的制备除不加入CAP外，其他反应条件同MIPMs。

1.3.2 孔容和孔径分析

精确称取0.1000g聚合物，70℃脱气4h后，采用BELSORP-mini比表面积和孔径测定仪，通过BET (Brunauer-Emmett-Teller)法测定比表面积，T-plot和MP法测定微孔容积和直径，BJH法测定中孔分布[12]。

1.3.3 分子印迹色谱柱的装填及色谱评价

称取2.5g聚合物于30mL异丙醇中，超声匀浆10min后，在20MPa压力下，以乙腈作为顶替液，湿法装柱(150mm×4.6mm)，以乙腈为流动相，直到获得稳定的基线。

甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的检测波长为226、223、278nm，进样体积为20μL。实验中，用丙酮测定死时间，保留因子k=(t－t0)/t0，其中，t为分析物的保留时间，t0为死时间。印迹因子IF=kMIP/ kNIP，其中，kMIP为分析物在分子印迹聚合物微球色谱柱上的保留因子，kNIP为分析物在对照聚合物微球色谱柱上的保留因子。选择因子α＝k1/k2，其中，k1为氯霉素的保留因子，k2为甲砜霉素和氟甲砜霉素的保留因子。保留指数RI＝αNIP/αMIP[13]。

2 结果与分析

2.1 微球的形态观察

图1 氯霉素分子印迹聚合物微球的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrographs of CAP MIPMs and NIPMs

MIPMs的制备过程中，分散剂作为一种在分子内同时具有亲油性和亲水性的界面活性剂，在微球的形成过程中起着重要的作用，本研究采用PVA1788 作为分散剂，以氯仿为致孔剂、采用两步溶胀聚合的方法制备得到分子印迹聚合物微球，采用扫描电镜对获得的MIPMs和NIPMs的表面形态及结构进行观察，如图1所示，获得的MIPMs平均粒径为4μm，且粒径比较均一，同时，可看到其表面呈多孔结构。

2.2 孔容及孔径分析

由图1可以看出，MIPMs和NIPMs粒径均一，表面都呈现多孔结构，因此，为更好的了解MIPMs的识别机理，采用氮气吸附-解吸附实验分析MIPMs和NIPMs的比表面积、孔体积和孔径，分析结果见表1，MIPMs与NIPMs相比，比表面积基本相同，但是，由于分子印迹效应的存在，从而导致MIPMs与NIPMs在孔体积和孔径上存在明显差异，MIPMs的孔体积和孔径均大于NIPMs，为模板分子及类似物与MIPMs的选择性识别提供了互补的空间结构。

表1 氯霉素MIPMs和NIPMs的孔结构特征Table 1 Pore structural characteristics of CAP MIPMs and NIPMs

2.3 选择性实验

根据分子印迹作用的原理，通常合成的聚合物对某一或某一类物质具有特异选择性，为更好地了解获得的MIPMs的选择性和色谱性能，通过色谱法研究MIPMs对CAP及其结构类似物TAP和FF的分离效果，结果如图2所示。流动相为MeCN-水(30:70，V/V)时，MIPMs相对于NIPMs(图2A、2C)，对CAP、TAP和FF表现出更好的色谱分离效果，但是三者未实现基线分离；而在流动相为MeCN-水-H3PO4(30:70:0.1，V/V)条件下，由图2B、D可以看到，与NIPMs相比，FF、CAP和TAP三种物质在MIPMs色谱柱中得到了更好的分离效果，表明获得的MIPMs成功实现了对CAP的印迹和识别。

进一步通过色谱分析得到CAP、FF和TAP(图3)的保留因子(k)、印迹因子(IF)、分离因子(α)和保留指数(RI)，对MIPMs的选择性能和色谱行为进行深入研究，其结果见表2。在流动相为MeCN-水(30:70，V/V)色谱条件下，MIPMs对CAP表现出了最大的k及IF，对FF、TAP的IF、α和RI依次减小；而且与NIPMs相比，MIPMs对CAP、FF和TAP都获得了更大的k，表明获得的MIPMs对CAP具有最好的保留能力(k)和印迹效果(IF)[13]。从CAP、FF和TAP的结构进行分析，如图3所示，CAP与TAP、FF相比，其－NO2基团被－SO2CH3代替，CAP与TAP都具有两个－OH，FF仅有一个－OH，另一个－OH被－F代替，表明空间效应在MIPMs的特异性识别中起到重要作用。进一步根据模板分子结构和功能单体的性质，MIPs的色谱性能与流动相的酸碱性有关[14]，由表2可以看出，在流动相MeCN-水-H3PO4(30:70:0.1，V/V)条件下，MIPMs对FF和TAP具有相似的IF和RI，表明MIPMs对FF和TAP

具有相似的印迹效果和识别选择性[12]，但是由于空间效应的存在，MIPMs对FF表现出更强的保留能力(k)；与流动相为MeCN-水(30:70，V/V)条件下相比，MIPMs对TAP表现出更好的IF和RI，而对FF的IF和RI则降低，因此可以得出，TAP的－OH基团在分子识别过程中起到非常重要的作用，表明离子键和氢键在MIPMs的识别过程中具有重要作用[14]。同时由于流动相为乙腈和水的混合溶液，而在水相溶液中，MIPs对模板分子及其类似物的识别主要有特异性和非特异性两种识别方式，其中，特异性识别主要来源于印迹过程，如氢键、离子键和空间效应等，而非特异性识别，如疏水作用力在印迹识别中起到非常重要的作用[15]。因此可以得出，MIPMs与目标物质之间的选择性相互作用是空间效应、氢键和离子相互作用、疏水相互作用协同作用的结果，从而对CAP表现出了最大的保留能力。

图3 CAP、FF和TAP的结构式Fig.3 Structure of CAP, FF and TAP

表2 pH值对氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素在MIPMs和NIPMs中 k, IF, α和RI的影响Table 2 Effect of different pH values on k, IF, αand RI of CAP, TAP and FF adsorption on CAP MIPMs and NIPMs

3 讨 论

3.1 以CAP为模板分子，以聚苯乙烯微球作为种球，通过两步溶胀聚合的方法合成了粒径大小均一的MIPMs，对CAP、FF和TAP三种物质表现出良好分离性能。

3.2 实验发现，获得的MIPMs作为液相色谱固定相出现色谱峰过宽和拖尾现象，主要原因是由于获得的分子印迹聚合物结合位点的非均一性所致[16]；总之，尽管MIPs用于色谱填料对CAP、FF和TAP的分离检测还存在一定的问题，但与常规液相色谱填料相比，由于分子印迹聚合物具有特定的识别能力及良好的理化特性，随着分子印迹技术理论及制备技术的成熟，分子印迹技术在分析化学领域的应用将更加广泛。

[1]VIVEKANANDAN K, SWAMY M G, PRASAD S, et al. A simple method of isolation of chloramphenicol in honey and its estimation by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19: 3025-3030.

[2]MOTTIER P, PARISOD V, GREMAUD E, et al. Determination of the antibiotic chloramphenicol in meat and seafood products by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2003, 994: 75-84.

[3]SCORTICHINI G, ANNUNZIATA L, HAOUET M N, et al. ELISA qualitative screening of chloramphenicol in muscle, eggs, honey and milk: method validation according to the Commission Decision 2002/ 657/EC criteria[J]. Anal Chim Acta, 2005, 535: 43-48.

[4]VIAS P, BALSALOBRE N, HERNNDEZ-CR M. Determination of chloramphenicol residues in animal feeds by liquid chromatography with photo-diode array detection[J]. Anal Chim Acta, 2006, 558: 11-15.

[5]SHEN Haoyu, JIANG Hailiang. Screening, determination and confirmation of chloramphenicol in seafood, meat and honey using ELISA, HPLC-UVD, GC-ECD, GC-MS-EI-SIM and GCMS-NCI-SIM methods [J]. Anal Chim Acta, 2005, 535: 33-41.

[6]ZHANG Suxia, LIU Zhongwei, GUO Xia, et al. Simultaneous determination and confirmation of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine in chicken muscle by liquid chromatography–tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2008, 875: 399-404.

[7]SHEN Jianzhong, XIA Xi, JIANG Haiyang, et al. Determination of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol, and florfenicol amine in poultry and porcine muscle and liver by gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2009, 877: 1523-1529.

[8]SCHIRMER C, MEISEL H. Synthesis of a molecularly imprinted polymer for the selective solid-phase extraction of chloramphenicol from honey[J]. J Chromatogr A, 2006, 1132: 325-328.

[9]BELTRAN A, MARCR M, CORMACK P A G, et al. Synthesis by precipitation polymerisation of molecularly imprinted polymer microspheres for the selective extraction of carbamazepine and oxcarbazepine from human urine[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216: 2248-2253.

[10]MAYES A G, WHITCOMBE M J. Synthetic strategies for the generation of molecularly imprinted organic polymers[J]. Adv Drug Del Rev, 2005, 57: 1742-1778.

[11]HAGINAKA J, TABO H, ICHITANI M, et al. Uniformly sized, molecularly imprinted polymers for (S)-epigallocatechin gallate, - epicatechin gallate and - gallocatechin gallate by multi-step swelling and polymerization method[J]. J Chromatogr A, 2007, 1156: 45-50.

[12]SHI Xizhi, WU Aibo, QU Guorun, et al. Development and characterisation of molecularly imprinted polymers based on methacrylic acid for selective recognition of drugs[J]. Biomaterials, 2007, 28: 3741-3749.

[13]URRACA J L, MARAZUELA M D, MERINO E R, et al. Molecularly imprinted polymers with a streamlined mimic for zearalenone analysis [J]. J Chromatogr A, 2006, 1116: 127-134.

[14]SHI Xizhi, WU Aibo, ZHENG Sulian, et al. Molecularly imprinted polymer microspheres for solid-phase extraction of chloramphenicol residues in foods[J]. J Chromatogr B, 2007, 850: 24-30.

[15]SCHIRMER C, MEISEL H. Chromatographic evaluation of polymers imprinted with analogs of chloramphenicol and application to selective solid-phase extraction[J]. Anal Bioanal Chem, 2009, 394: 2249-2255.

[16]HWANG C C, LEE W C. Chromatographic characteristics of cholesterol-imprinted polymers prepared by covalent and non-covalent imprinting methods[J]. J Chromatogr A, 2002, 962: 69-78.

Preparation and Chromatographic Evaluation of Molecularly Imprinted Polymer Microspheres for Chloramphenicol

SHI Xi-zhi1，YANG Hua2，SUN Ai-li1，LI De-xiang1，CHEN Jiong1
(1. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

A uniformly sized molecularly imprinted polymer microspheres (MIPMs) for chloramphenicol (CAP) has been prepared by a two-step swelling and polymerization method using 2-(Diethylamino) ethyl methacrylate (DEAEM), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) and polystyrene microspheres as the functional monomer, cross-linker and seed particles, respectively. The porous surface of MIPMs could be clearly observed under scanning electron microscope (SEM). Furthermore, the MIPMs had a larger pore volume and pore diameter measured using BELSORP-miniII than the non-imprinted polymer microspheres (NIPMs) did. The selectivity of MIPMs was assessed by chromatographic method, and CAP, thiamphenicol (TAP) and florfenicol (FF) could reach a stronger separation on the MIPMs with a MeCN/water/H3PO4mixture (30:70:0.1, V/V) as the mobile phase.

chloramphenicol；molecularly imprinted polymer microspheres；thiamphenicol；florfenicol

O652.63

A

1002-6630(2010)18-0095-04

2010-05-18

宁波市自然科学基金项目(2009A610146)；浙江省教育厅高校科研计划项目(Y200803423)；国家“863”计划项目(2006AA10Z438)

史西志(1979—)，男，讲师，博士，研究方向为生物安全。E-mail：sxzsa178@yahoo.com.cn