新疆准噶尔铁线莲不同部位多糖提取工艺优化

古丽巴哈尔·阿巴拜克力

(新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

新疆准噶尔铁线莲不同部位多糖提取工艺优化

古丽巴哈尔·阿巴拜克力

(新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

采用分光光度法，以葡萄糖为标准样品测定新疆准噶尔铁线莲不同部位中的多糖含量，采用正交试验设计对其不同部位中多糖提取工艺进行最佳筛选、优化。分别得到的最佳提取工艺条件为：茎：温度90℃、浸提时间2.5h、料液比1:60(g/mL)、提取次数5次，OD值达0.408；叶：温度90℃、浸提时间2h、料液比1:60 (g/mL)，提取次数5次，OD值达0.493；花：温度90℃, 时间2h，料液比1:60，提取次数4次，OD值达0.418；果实：温度90℃、浸提时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数5次，OD值达0.315。

准噶尔铁线莲；多糖；提取工艺；优化

多糖的保健功能是目前保健食品功能因子中研究焦点之一。近年来，有大量有关多糖保健功能的研究报道，主要方面有调节免疫功能、抗肿瘤作用、抗凝血作用，此外，多糖还具有抗衰老、解毒、抗病毒、降血糖、降血脂、抗消化性溃疡、促进核酸与蛋白质的生物合成，阻止放射性元素和抗辐射以及早期引产作用等功效。虽然到目前为止，只有少数药用植物多糖用于临床，但随着多糖的制备、结构、合成、药理学及临床学研究的不断深入，多糖药物将具有更广阔的前景[1]。

准噶尔铁线莲(Clematis songarica Bge.)毛茛科铁线莲属，主要产于新疆、内蒙古西部，蒙古、中亚荒漠地区也有分布。生长于荒漠低山麓前洪积扇，石砾质冲积堆以及荒漠河岸[2-3]。

目前，国内外关于准噶尔铁线莲有效成分的报道极少，准噶尔铁线莲在新疆的分布极广，为了充分开发利用这一资源，研究一种操作方法稳定、简便的提取工艺，提高有效成分的提取率，本研究以准噶尔铁线莲多糖含量为指标，采用正交试验设计对准噶尔铁线莲不同部位进行最佳提取工艺的筛选。以期为开发和利用其有效成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

准噶尔铁线莲采自新疆乌鲁木齐县永丰乡农田田埂等地。

碘、蒽酮、丙酮、乙醚、氯仿、浓硫酸、葡萄糖、正丁醇、5%α-萘酚水溶液、无水乙醇。

HH-S型水浴锅；回流提取装置；S24分光光度计；722型分光光度计；101A-1型干燥箱；RE-52旋转蒸发器；SHZ-D循环水式真空泵；LAC164分析天平(感量0.0001g)。

1.2 方法

1.2.1 多糖类物质的鉴定方法[4-5]

取样品粉末适量，加水10倍量，室温浸泡过夜，在60℃水谷中加热30min，过滤，滤液分别加碘液，α-萘酚水试剂，观察反应结果见表1。

1.2.2 铁线莲不同部位多糖的测定[6-7]

1.2.2.1 标准溶液的配制及标准曲线制作

称取105℃干燥至恒质量的葡萄糖标准品1g，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，移取1mL该标准液于100mL的容量瓶中，加蒸馏水定容，配成100 μg/mL的标准溶液。

分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL标准溶液，置于10mL容量瓶中定容，配成系列标准溶液。在波长600nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，做标准曲线，标准曲线的回归方程为：y=0.034x+0.007，R2=0.9989，在2～20 μg/mL范围内对照品的量与吸光度有良好的线性关系。

1.2.2.2 样品中多糖含量测定[8]

称取干燥恒质量的精制准噶尔铁线莲不同部位的多糖30mg，置于250mL的容量瓶中，加入蒸馏水定容(可以稍微加热助溶多糖)，制得准噶尔铁线莲多糖贮备液。测定准噶尔铁线莲多糖贮备液的OD值，由回归方程求出准噶尔铁线莲多糖贮备液中葡萄糖质量浓度，按式(1)计算换算因子(f)。

式中：m为称取多糖的质量/μg；c为精制准噶尔铁线莲多糖贮备液中葡萄糖的质量浓度/(μg/mL)；D为多糖的稀释因素。

吸取样品贮备液1mL，由回归方程计算样品液中葡萄糖浓度(c)，按照式(2)计算样品中多糖的含量。

式中：c1为样品贮备液中葡萄糖的质量浓度/(μg/ mL)；D为多糖的稀释因素；f为换算因子；m为称取多糖的质量/μg。

1.2.2.3 稳定性实验[8]

取样品贮备液1mL，测定OD值，每隔1h测定1次，连续4 h，考察生成物颜色的稳定性。

1.2.3 铁线莲多糖不同部位提取的单因素试验

1.2.3.1 提取温度对提取效果的影响

在温度分别为60、70、80、90、100℃时，以蒸馏水为提取溶剂，在料液比为1:30(g/mL)，时间为2h的提取条件下分别浸泡提取2次，测定其OD值。

1.2.3.2 浸泡时间对提取效果的影响

在料液比为1:30，温度为90℃的提取条件下分别浸泡0.5、1、1.5、2、2.5h、分别提取2次，合并滤液，测定其O D值。

1.2.3.3 料液比对提取效果的影响

分别用20、30、40、50、60倍量溶剂在温度为90℃，浸泡时间每次2h的提取条件下提取2次，测定其O D值。

1.2.3.4 提取次数对提取效果的影响

分别在温度为90℃，料液比为1:30，每次2h的提取条件下进行1、2、3、4、5次提取，测定其OD值。1.3正交试验设计

根据单因素试验结果，以多糖提取率为考察指标，选取提取温度、提取时间、料液比和次数作为考察因素，各取3个水平，进行正交试验设计，觅粗多糖的提取工艺条件并对优化条件进行验证实验。

2 结果与分析

2.1 多糖的鉴定

显色反应结果见表1，说明准噶尔铁线莲含有多糖类化合物。

表1 显色反应结果Table1 Results of color reactions

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对多糖提取率的影响

图1 温度对准噶尔铁线莲多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

提取温度对准噶尔铁线莲多糖提取率的影响如图1显示，多糖提取率随温度升高而升高，达到一定温度时提取率最高，随后温度再升高则呈现下降趋势。温度的升高，有助于传质过程，使分子扩散运动加剧，加快溶质的扩散和溶剂的渗透，有利于多糖物质的溶出；但随着温度的升高，也可能会导致部分多糖物质的分解而使多糖提取率下降。所以茎、叶、花、果实均选择选择80～100℃，作为提取操作条件。

2.2.2 提取时间对多糖提取率的影响

图2 提取时间对准噶尔铁线莲多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

提取时间对准噶尔铁线莲多糖提取率的影响如图2所示，多糖提取率随时间的延长而升高，达到一定时提取率最高，随后时间再延长则呈现下降趋势。时间的延长，有助于传质过程，使分子充分扩散，有利于多糖物质的溶出；但随着时间的延长，也可能会导致部分多糖物质的分解或部分其他物质的溶解而使多糖提取率下降。所以茎、叶、花、果实均选择选择1.5～2.5h作为提取操作条件。

2.2.3 料液比对多糖提取率的影响

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig. 3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

如图3所示，采用不同料液比进行浸提时多糖提取率有差别，料液比实际上是溶剂的用量大小，一般溶剂的用量越大提取率也越大，但是过多的溶剂用量会造成溶剂和能源的浪费，综合考虑，准噶尔铁线莲叶、茎、花、果实部选择1:40～1:60(g/mL)料液比作为操作条件。

2.2.4 提取次数对多糖提取率的影响

图4 提取次数对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of repeated extraction number on extraction rate of polysaccharides

如图4所示，采用不同提取次数进行浸提时多糖提取率有差别，一般当提取次数越多提取率也越大，综合考虑，准噶尔铁线莲叶、茎、花、果实部选择3～5次作为操作条件。

2.3 正交试验设计

准噶尔铁线莲叶、茎、花、果实多糖提取四因素三水平试验设计如表2所示。

表2 L9(34)正交试验因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal experiments

2.3.1 准噶尔铁线莲茎多糖提取正交试验

表3 准噶尔铁线莲茎多糖提取正交试验结果Table3 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from stem of Clematis songarica Bge.

综合以上单因素试验考察结果，以提取温度A、提取时间B、料液比C、提取次数D为因素对准噶尔铁线莲不同部位作正交试验，准噶尔铁线莲茎正交试验因素水平见表3。

表4 准噶尔铁线莲茎多糖提取方差分析表Table4 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from stem of Clematis songarica Bge.

通过比较极差，判断得到B＞A＞C＞D，4种考察因素对多糖提取率的影响顺序为提取时间＞提取温度＞料液比＞提取次数，即提取因子中时间对提取率影响最大。提取准噶尔铁线莲茎中多糖的最佳条件为A2B3C3D3，即提取温度90℃、提取时间2.5h、料液比为1:60(g/mL)；提取次数5次。这4种因子对多糖提取率的影响都不显著。在最终选取的提取工艺条件下，进行了多糖的含量测定，OD值达0.408。

2.3.2 准噶尔铁线莲叶多糖提取正交试验

表5 准噶尔铁线莲叶多糖提取正交试验结果Table5 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from leaves of Clematis songarica Bge.

表6 准噶尔铁线莲叶多糖提取方差分析表Table6 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from leaves of Clematis songarica Bge.

根据表5和表6，通过比较极差，判断得到A＞ D＞C＞B，4种考察因素对多糖提取率的影响顺序为提取温度＞提取次数＞料液比＞提取时间，即提取因子中提取温度对提取率影响最大，提取温度90℃最适宜。方差分析表还表明，提取准噶尔铁线莲叶中多糖的最佳条件为A2B2C3D3，即提取温度90℃、提取时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数5次。这4种因子对多糖提取率的影响都不显著。在最终选取的提取工艺条件下，进行了多糖的含量测定，OD值达0.493。

2.3.3 准噶尔铁线莲花多糖提取正交试验

表7 准噶尔铁线莲花多糖提取正交试验结果Table7 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from flowers of Clematis songarica Bge.

表8 准噶尔铁线莲花多糖提取方差分析表Table8 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from flowers of Clematis songarica Bge.

根据正交试验表，通过比较极差，4种考察因素对多糖提取率的影响顺序为提取温度＞提取时间＞料液比＞提取次数(A＞B＞C＞D)，即提取因子中提取温度对提取率影响最大，提取温度90℃最适宜，提取准噶尔铁线莲花中多糖的最佳条件为A2B2C3D2，即提取温度90℃、提取时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数4次。这4种因子对多糖提取率的影响都不显著。在最终选取的提取工艺条件下，进行了多糖的含量测定，OD值达0.418。

2.3.4 准噶尔铁线莲果实多糖提取正交试验

根据正交试验表，通过比较极差，判断得到A＞C＞D＞B，4种考察因素对多糖提取率的影响顺序为提取温度＞料液比＞提取次数＞提取时间，即提取因子

中提取温度对提取率影响最大，提取温度90℃最适宜。方差分析表还表明，提取准噶尔铁线莲果实中多糖的最佳条件为A2B2C3D3，即提取温度90℃、提取时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数5次。这4种因子对多糖提取率的影响都不显著。在最终选取的提取工艺条件下，进行了多糖的含量测定，OD值达0.315。

表9 准噶尔铁线莲果实多糖提取正交试验结果Table9 Results of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from fruits of Clematis songarica Bge.

表10 准噶尔铁线莲果实多糖提取方差分析表Table10 Variance analysis of orthogonal experiments for polysaccharide extraction from fruits of Clematis songarica Bge.

2.4 准噶尔铁线莲不同部位多糖含量测定

表11 准噶尔铁线莲不同药用部位多糖含量测定结果Table11 Content of polysaccharides extracted from different parts of Clematis songarica Bge.

在最佳工艺条件下进行提取，结果表明：准噶尔铁线莲不同部位中叶部多糖含量最高，花部含量较高，茎含量其次，其中果实部含量最低。

2.5 稳定性实验

考察最佳提取工艺条件下，所提取的铁线莲各部位的多糖溶液的稳定性，结果如表12所示，4h内准噶尔铁线莲茎、叶、花、果实多糖溶液的O D值稳定。

表12 多糖测定的稳定性结果Table12 Stability of polysaccharides

3 结 论

3.1 经两种多糖试剂鉴定，均呈明显的多糖反应，现象分别为紫色与深蓝黑色，证实有多糖成分存在。

3.2 本实验用热水提取法对准噶尔铁线莲不同部位进行了多糖提取，采用分光光度法测定总多糖含量，正交试验结果表明，准噶尔铁线莲不同部位中叶部多糖含量最高，花部含量较高，茎部含量其次，果实含量最低。

3.3 本实验采用正交试验设计对准噶尔线莲不同部位中总多糖提取工艺进行了最佳筛选，4种因素对不同部位总多糖含量测定均有影响，分别得到的最佳提取工艺条件为：茎：提取时间2.5h、料液比1:60(g/mL)、提取温度90℃、提取次数为5次，OD值为0.408；叶：提取温度90℃、提取时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数为5次，OD值为0.493；花：提取温度90℃、提取时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数为4次，OD值为0.418；果实：提取温度90℃、提取时间2h、料液比1:60(g/mL)、提取次数为5次，OD值为0.315。3.4本实验采用分光光度法测定总多糖含量，结果表明4h内样品的吸光度稳定，本法可作为测定准噶尔铁线莲中的总多糖含量的方法。

[1]韦巍, 李雪华. 多糖的研究进展[J]. 国外医学: 药学分册, 2005, 32 (3): 179-184.

[2]新疆植物志编辑委员会. 新疆植物志[M]. 乌鲁木齐: 新疆科技卫生出版社, 1994.

[3]黄文武. 铁线莲属植物的研究进展[J]. 中草药, 2002, 33(3): 285-288．

[4]吴剑峰. 天然药物化学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 240-249．

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[6]齐慧玲, 高波. Sevage法去除白及多糖中蛋白的研究[J]. 天津化工, 2000, 20(3): 20-22.

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[8]韩阳花, 高莉, 刘丽艳, 等. 酸浆果实中多糖的提取及含量测定[J].食品科学, 2006, 28(11): 500-503.

Optimal Extraction of Polysaccharides from Different Parts of Clematis songarica Bge. in Xinjiang

GULIBAHAER Ababaikeli
(College of Life Science, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)

Polysaccharides were extracted from different parts of Clematis songarica Bge. and determined by using spectrophotometry method with glucose as the standard. The optimal extraction parameters of polysaccharides were explored by orthogonal experiments to be extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time of 2.5 h and repeated extraction number of 5 for stem; extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time of 2 h and repeated extraction number of 5 for leaves; extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time of 2 h and repeated extraction number of 5 for flowers; extraction temperature of 90 ℃, material-liquid ratio of 1: 60, extraction time 2 h and repeated extraction number of 5 for fruits. The absorbance of polysaccharides extracted from stem, leaves, flowers and fruits at 600 nm were 0.408, 0.493, 0.418 and 0.315, respectively.

Clematis songarica Bge.；polysaccharides；extraction processing；optimization

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0198-05

2010-08-18

古丽巴哈尔·阿巴拜克力(1969—)，女，副教授，硕士，研究方向为植物有效成分分析。E-mail：gvlbahar.a@163.com