发酵乳杆菌SM-7的筛选及对小鼠降胆固醇作用

严玉婷，潘道东,2,*

(1.南京师范大学 国家乳品加工技术研发分中心，江苏 南京 210097；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

发酵乳杆菌SM-7的筛选及对小鼠降胆固醇作用

严玉婷1，潘道东1,2,*

(1.南京师范大学 国家乳品加工技术研发分中心，江苏 南京 210097；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

筛选1株具有高效降胆固醇活性的乳酸菌菌株并研究其降胆固醇的特性。采用分离自新疆酸马奶的10株乳酸菌，通过益生活性的测定以及降胆固醇实验筛选得到1株具有高效降胆固醇的益生菌株SM-7，经过鉴定为发酵乳杆菌。该菌株在液体培养基中的胆固醇脱除率为66.82%，用该菌液饲喂小鼠4周，研究其对小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及体质量和肝、肾质量的影响。结果显示，实验组小鼠的血清TC、TG、LDL-C含量均显著低于高脂模型组(P＜0.01)，而HDL-C含量没有显著差异(P＞0.05)。这表明发酵乳杆菌SM-7对实验性高脂血症小鼠血清有显著的降胆固醇作用。

发酵乳杆菌；筛选；降胆固醇；作用机理

随着人们生活水平不断提高，心血管疾病患病率和死亡率也逐年上升，已成为引起人类死亡的主要杀手。血清中的胆固醇则被认为是诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素[1]。血清胆固醇含量每高于正常值1mmol/L，冠心病发生率增加35%左右，而其含量降低1%，冠心病发生率减少2%～3%[2]。因此，降低血清胆固醇水平直接关系到人类的健康。

自1974年Mann和Spoerry发现非洲马赛人大量饮用由乳杆菌发酵的乳制品，其体内血清胆固醇含量普遍较低后，国内外的大量学者便致力于研究乳酸菌降胆固醇的作用上。研究表明，某些乳酸菌的摄入可降低血胆固醇的浓度，减少心脑血管疾病的发生率。本实验采用从酸马奶中筛选得到的1株具有益生活性的发酵乳杆菌，对模型小鼠的降胆固醇效果进行研究，以期为开发降血脂和预防心血管疾病的保健食品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

10株乳酸菌，编号为SM-1～SM-10分离自新疆酸马奶，由南京师范大学金陵女子学院乳品研究所保藏。

MRS液体培养基[3]；含胆固醇100mg/L和0.3g/100mL牛胆盐的MRS液体培养基(MRS-CHOL培养基)；血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)测定试剂盒 浙江东瓯生物工程有限公司。其他所用试剂均为分析纯。

722型可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；高速冷冻离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高效降胆固醇乳酸菌的筛选与鉴定

1.2.1.1 菌株耐受酸与胆盐能力测定

将活化3代的乳酸菌按1%的接种量接入pH3.0的MRS液体培养基中，37℃静置培养12h后，观察各个菌的生长情况并记录。同时按1%的接种量接入不含牛胆盐(即空白)以及含0.3g/100mL牛胆盐的MRS培养基中，37℃培养12h后，于波长620nm处分别测定上述两种培养基的光密度值(OD620nm)，计算各菌株在含胆盐培养基中的存活率。实验重复3次取平均值。

1.2.1.2 乳酸菌的筛选

将活化3代的乳酸菌株1%接种于MRS-CHOL培养基中，37℃培养24h后用邻苯二甲醛法[4]测定菌液上清液、洗涤液、菌体破碎液中胆固醇的质量分数，以未接种乳酸菌的培养基作为空白，并根据上清液中胆固醇的质量分数计算培养基中胆固醇的脱除率，实验重复3次取平均值。

上清液：菌株在MRS-CHOL培养基中培养24h后于4000r/min离心10min后的液相部分；洗涤液：在倾出上清液的菌体细胞中加入10mL浓度为0.1mol/L (pH7.0) PBS缓冲液，洗涤2次后4000r/min离心10min所得的液体；破碎液：倾出菌体洗涤液，再加入5.0mL PBS缓冲液，置冰浴中，超声波细胞粉碎机功率为600W下破碎10min后，4000r/min离心10min所得液体。

1.2.1.3 乳酸菌的鉴定

运用API细菌鉴定系统鉴定所筛选菌株。

1.2.2 乳杆菌体内降胆固醇实验

1.2.2.1 灌胃菌体的制备

活化的选定的最佳菌株以10%接入1000mL MRS液体培养基中，37℃培养12h后，离心收集菌体。沉淀的菌体用50mL，10%的脱脂乳(质量分数)悬浮，分装于10mL的离心管中，在－70℃迅速冷冻待用。灌胃前把盛菌体的离心管置于25℃水浴融化，用灭菌生理盐水适当稀释后平板菌落计数。根据计数结果，每次灌胃前用10%脱脂乳将菌液稀释至所需浓度。

1.2.2.2 高脂饲料的制备

高脂饲料含基础饲料83.8%、猪油10%、蛋黄5%、胆固醇1%、牛胆盐0.2%、混合均匀后手工制成颗粒并置于通风干燥处待用。

1.2.2.3 动物分组及实验方案

ICR小鼠(雄性)50只，体质量(18±2)g，购于南京医科大学实验动物中心。普通饲料适应性饲养1周后，随机分为5组，每组10只，连续饲喂不同的饲料和菌液4周(具体的分组及饲喂方式见表1)，每周称1次体质量，并依次调整灌胃量。在实验的第0、2、4周分别剪尾采血(采血前禁食12h，不禁水)，离心分离血清，检测血清TC、TG和HDL-C水平。

小鼠每天定量饲喂(上午喂食，食量为每只每天5g)，自由饮水，按照表1中方案，每天上午对小鼠灌胃，并保持饲养房的通风、透光和清洁卫生。

表1 实验动物分组及饲养方式Table 1 Animal grouping and feeding styles

1.2.2.4 检测指标及方法

按照试剂盒说明书要求测定血清TC、TG和HDL-C的含量，并由公式计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量、动脉粥样硬化指数(A I)及抗动脉粥样硬化指数(AAI)[5]。

1.3 数据统计处理

所有数据经SPSS13.0统计软件处理后用x±s表示，组间差异采用t检验，P＞0.05表示无显著性差异，

P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示差异非常显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌pH3.0耐酸性和耐胆盐实验的筛选

表2 乳酸菌对0.3g/100mL胆盐环境和pH3.0酸性环境的耐受能力Table 2 The tolerance capability of LAB to bile salt and acids

由表2可知，10株乳酸菌中，SM-9和SM-10不耐受pH3.0的酸性环境，几乎不能生长，菌株SM-3生长缓慢，其余7株乳酸菌对pH3.0的酸性环境有较强的耐受力，不影响生长。添加0.3g/100mL耐胆盐实验显示，各株菌均具有一定的胆盐耐受力，其中SM-7最强，存活率为87.97%。综上，根据10株菌对酸和高胆盐环境的耐受力的高低，选择SM-7、SM-1、SM-8、SM-4和SM-2株菌进行下一步实验。

2.2 高效降胆固醇乳酸菌的体外筛选及鉴定

图1 5株乳酸菌的体外降胆固醇效果Fig.1 Cholesterol-reducing effect of LABin vitro

由图1可知，经2.2节实验筛选的5株菌均有降胆固醇的作用，但各菌株间的胆固醇脱除率有较大差异。菌株SM-7对培养基中胆固醇的脱除率最高，为66.82%，其他依次为SM-4、SM-1、SM-8、SM-2，它们的胆固醇脱除率分别为41.89%、34.79%、31.60%、15.12%。同时，本实验结果表明，菌体细胞破碎后所得胆固醇的质量分数与上清液胆固醇减少量和沉淀中胆固醇增加量间的差值相差无几，这表明乳酸菌可以同化胆固醇到自身细胞内，菌株SM-7破碎液中胆固醇质量分数最高，表明其同化胆固醇能力最强。

综合考虑耐酸耐胆盐和降胆固醇实验的结果，最后筛选得菌株SM-7进行体内实验。经过API细菌鉴定系统的鉴定，菌株SM-7属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。

2.3 发酵乳杆菌SM-7体内降胆固醇实验

2.3.1 小鼠高脂血症模型的建立

表3 饲喂普通饲料小鼠与高脂饲料小鼠血脂变化(x±s，n=10)Table 3 Change in serum lipid level of mice fed with basic and high-cholesterol food (x±s，n=10)

表4 SM-7对小鼠血脂的影响(x±s，n=10)Table 4 Effect of strain SM-7 on serum TC,TG,HDL-C and LDL-C of mice with hyperlipemia (x±s，n=10)

由表3可见，整个实验期间，普通组小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的浓度都保持稳定(P＞0.05)。高脂组在饲喂高脂饲料14d后，血清TC浓度与普通组相比明显升高，两者差异极其显著(P＜0.01)，TG浓度也

有所升高，且与普通组差异显著(P＜0.05)。而高脂奶粉组中各指标变化与高脂组基本相同，两组间无显著差异(P＞0.05)，说明奶粉本身没有降血脂的功能。在饲喂高脂饲料28d后，高脂组、高脂奶粉组的小鼠血清TC、TG浓度均与普通组相比差异极显著(P＜0.01)，表明造模成功。

2.3.2 发酵乳杆菌SM-7对高脂血症小鼠血脂的影响

由表4可知，经过28d的灌胃实验后，与高脂组相比，发酵乳杆菌SM-7高浓度组的血清TC和TG含量均得到抑制，且效果明显(P＜0.01)，较高脂组分别下降了24.05%和36.73%；而SM-7低浓度组的血清TC和TG含量亦有所下降，分别为13.07%和19.05%。SM-7对血清LDL-C起到了极显著性降低作用(P＜0.01)，但对血清HDL-C的作用不明显，虽然相比高脂组略有升高，但差异不显著(P＞0.05)。通过计算得到的动脉粥样硬化指数AI和抗动脉粥样硬化指数AAI可以看出，菌株SM-7的高、低浓度组均可显著降低AI值和显著升高AAI值，其中高浓度组效果极显著，这说明SM-7具有一定的调节血脂的功效，对预防心血管疾病具有显著的效果。

2.3.3 发酵乳杆菌SM-7对高脂血症小鼠体质量的影响

实验期间，各组小鼠毛色光洁，食欲正常，未出现异常体征，未发生自然死亡。小鼠体质量及肝、肾与体质量的百分比如表5所示。

表5 SM-7对小鼠体质量及脏器质量与体质量比的影响(x±s，n=10)Table 5 Effect of strain SM-7 on body weight and viscera weight of mice with hyperlipemia (x±s，n=10)

由表5可见，实验前，各组间小鼠体质量无显著性差异(P＞0.05)。而在实验结束时，虽然饲喂高脂饲料的4组小鼠的体质量均高于普通组，但与普通组相比没有显著性差异(P＞0.05)，同时各组间肾质量/体质量的百分数也未有显著性差异(P＞0.05)，这表明实验期间小鼠灌胃发酵乳杆菌SM-7未见明显的毒副作用[6]。饲喂高脂饲料的4组小鼠的肝质量/体质量的值均明显高于普通组，高脂组与高脂奶粉组间差异不显著(P＞0.05)，而灌胃SM-7菌体的SM-7高、低浓度组的值均低于高脂组和高脂奶粉组，其中SM-7高浓度组分别与高脂组和高脂奶粉组相比差异显著(P＜0.05)，而SM-7低浓度组分别与高脂组和高脂奶粉组差异不显著(P＞0.05)，这表明高浓度的SM-7能够减少脂肪在小鼠肝脏中的囤积。

3 讨 论

近年来，国内外大量研究发现，食用活性乳酸菌食品具有减少人体血清胆固醇的能力，这一结论也被大量体内体外实验所证实。而菌体进入机体后，要能抵达胃肠道的特定部位并定植才能发挥有益作用。而胃肠道的低pH值和高胆汁酸盐(人体消化道正常pH值范围为2～8，正常胆汁酸盐浓度为0.3%～0.5%)[7]是影响乳酸菌定植的主要障碍。本实验从新疆酸马奶中分离鉴定得到的一株发酵乳杆菌SM-7，不仅具有高效降胆固醇的活性，其胆固醇脱除率可达66.82%，而且具有较好的耐酸、耐胆盐的能力，能够较好的耐受胃肠道的环境，更好的发挥其在体内降胆固醇的作用。

在体外实验中，在乳酸菌培养过程中培养基上清液、沉淀洗涤液和细胞破碎液中均测得胆固醇质量分数，这说明实验所用乳酸菌株对胆固醇去除都是共沉淀与吸收作用的共同结果，但它们在去除胆固醇的机理方面存在一定的菌株特异性。通过计算发现，将细胞内与洗涤沉淀所得的两部分胆固醇相加，发现与培养基中胆固醇的减少量几乎相等，证明菌株吸收的胆固醇没有被降解为小分子，这与Tahri等[8]研究双歧杆菌、Kimoto等[9]研究Lactococcus lactis时所得结论相似。

用发酵乳杆菌SM-7灌胃ICR小鼠实验结果表明，SM-7能显著降低血清TC、TG和LDL-C的浓度，而各组间血清HDL-C的含量差异不显著，说明HDL-C值不易受外界因素的影响而发生变化。动脉粥样硬化指数AI和抗动脉粥样硬化指数AAI也发生显著变化，这说明SM-7具有降低体内胆固醇的作用。从本实验结果看，实验组血清TC的减少不仅与LDL-C的减少有关，还可能与胆固醇的合成减少或代谢加速有关，因为实验组小鼠的肝质量/体质量比高脂组显著降低，说明肝脏对胆固醇的排出量增多[10]。大量实验证明某些乳酸菌在代谢过程中分泌的胆盐水解酶具有沉淀去除胆固醇的能力[11]，然而也有实验证实，某些不具胆盐水解酶活性的乳酸菌也能很好的去除胆固醇，而有酶活性的菌株却未能很好地去除胆固醇[12-13]。目前有关乳酸菌降胆固醇的作用机制尚不完全清楚，有待进一步的实验研究。

综上所述，发酵乳杆菌SM-7具有良好的降胆固醇功效，作为一种预防心血管疾病的功能性菌株，在开发降血清胆固醇功能性乳制品方面具有广阔的市场前景。

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Screening and Hypocholesterolemic Effect of Lactobacillus fermentum

YAN Yu-ting1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The strain SM-7 with hpocholesterolemic activity was screened from 10 lactic acid bacteria (LAB) strains isolated from koumiss in Xinjiang and its hpocholesterolemic effect in mice was investigated. The SM-7 was identified as Lactobacillus fermentum and could reduce 66.82% of cholesterol in the medium. The effect of strain SM-7 on serum TC, TG, HDL-C, LDLC, body weight, liver and kidney were investigated in ICR mice with hyperlipemia. Results showed serum TC, TG and LDL-C concentrations were exhibited a significant decrease (P ＜ 0.01) while no obv ious change was observed in serum HDL-C concentration (P ＞ 0.05). These investigations suggested that Lactobacillus fermentum SM-7 strain had a significant effect on cholesterol-reducing function in mice with hyperlipemia.

Lactobacillus fermentum；screening；cholesterol-reducing；mechanism

Q939.117

A

1002-6630(2010)09-0224-05

2009-09-05

国家“863”计划项目(2007AA10Z357)；国家自然科学基金项目(30972130)；国家农转基金项目(2009GB2C220412)；江苏省科技支撑计划项目(BE2009366)

严玉婷(1985—)，女，硕士研究生，主要从事乳品科学研究。E-mail：nevsay88@qq.com

*通信作者：潘道东(1964—)，男，教授，博士，主要从事乳品科学研究。E-mail：daodongpan@163.com