依达拉奉对谷氨酸诱导神经元释放一氧化氮的影响

谭少华,林耀波,李丽娟

(番禺区中心医院神经内科,广东 广州 511400)

谷氨酸(Glutamate,Glu)是神经系统内的兴奋性氨基酸,作为神经递质之一参与体内多种病理生理过程,在脑部缺血缺氧过程中,过多的谷氨酸产生的兴奋毒性作用可能引起神经元的凋死亡。一氧化氮(Nitric oxide,NO)作为一种血管舒张因子,不仅对心血管功能有调节作用,还起着神经递质的作用[1],有报道发现 NO参与了谷氨酸介导兴奋毒性作用[2]。依达拉奉作为一种自由基清除剂,对缺血缺氧状态下的神经元的保护作用已得到众多的研究证实。本研究旨在探讨依达拉奉对谷氨酸毒性作用下诱导的神经元释放 NO的影响,进一步阐明依达拉奉保护神经元的作用机制。

1 材料与方法

1.1 原代神经元的培养 根据文献方法并作出改良[3],将出生 24 h内的 SD大鼠分离脑组织后,以一次性注射器(5 ml)针头捣烂脑组织,注射器反复抽吸 3次,加入 0.125%胰酶(含 0.2‰EDTA)3 ml,置入 37℃水浴箱持续震荡消化 3-5 min。细胞计数后调整细胞数目为 106/ml,接种于已用多聚赖氨酸铺板的 6孔培养板上,24 h后换液,并加入阿糖胞苷 -C(终浓度为 10μM)抑制其他细胞生长。24 h后再次换液,终止阿糖胞苷 -C的作用。以后每 2-3 d换上述培养液 1次,培养 7 d后用于实验。

1.2 神经元纯度鉴定 原代神经元培养 7 d后,神经元特异烯醇化酶 (NSE)染色确定分离培养神经元纯度:PBS冲洗后加入一抗(兔抗大鼠 NSE:1∶200),4℃冰箱过夜,次日室温下放置 30 min,加入二抗(山羊抗兔 IgG,1∶200),观察 NSE阳性细胞率。

1.3 实验分组 原代神经元培养 7 d后,实验分为三组,空白对照组、Glu(50μM)组以及 Glu(50 μM)+Eda(100μM)组,分别在加入上述药物处理前、6 h及 24 h后提取三组培养基作 NO浓度检测。

1.4 NO的检测 收集各组培养基后,采用硝酸还原酶法检测。严格按照 NO试剂盒中的检测步骤,在半自动生化分析仪(ZS/1S,北京中山生物公司)上检测。

1.5 统计学分析 用 SPSS13.0统计软件分析。计量资料采用(x±s)表示;数据处理采用单因素方差分析,双尾 t检验,以 P值 0.01或者 0.05作为统计学差异界限。

2 结 果

2.1 培养神经元的纯度鉴定 NSE是神经元特异性酶,NSE染色是用来鉴定神经元的常用方法。本实验分离的细胞 NSE染色后可见 95%以上的细胞呈梭形或椭圆形,细胞连接成网状,细胞边缘清晰,突起、胞膜及胞浆染色呈棕黄色,细胞核染色呈淡蓝紫色,细胞有明显的突起,提示其神经元纯度超过 95%,证实我们培养方法的可靠性。

2.2 谷氨酸对神经元释放 NO的影响 如表 1及图 1所示,加药前三组培养基的 NO浓度基本一致(P＞0.05),加入谷氨酸 6 h及 24 h后,培养基中的 NO浓度明显升高(P＜0.01),提示谷氨酸能诱导体外培养神经元释放 NO。

图1 各组不同时间 NO浓度的变化注:6 h三组间方差分析:F=21.739,P=0.000,与对照组比较,aP=0.000,bP=0.033,Glu组与 Glu+Eda组比较,c P=0.002;24 h三组间方差分析:F=38.366,P=0.000,与对照组比较,d P=0.000,eP=0.027,Glu组与 Glu+Eda组比较,f P=0.000。

表1 加药前后各组培养液中 NO的浓度(x±s,n=10)

如表 1所见,各组培养基中 NO的浓度均随时间推移有所上升,为进一步阐明 Glu诱导神经元释放 NO有无时间依赖性,分别将各组在三个不同时间点检测的 NO浓度做自身对比(配对 T-test)。

2.3 各组自身加药前后对照配对 T-test结果

如表 2所见,对照组在加药 6 h、24 h NO浓度仅轻微上升,但差异无统计学意义(P＞0.05),而Glu组、Glu+Eda组在加药 6 h、24 h后两个时间点均较加药前有明显的上升(P＜0.01);Glu组、Glu+Eda组加药后 6 h与 24 h相比,NO浓度虽然都有轻微升高,但差异均无统计学意义(P＞0.05),提示谷氨酸诱导神经元释放 NO无明显时间依赖性,在 Glu作用6 h后,NO的释放并无随时间的延长有明显进一步加强。

表2 各组自身加药前后对照配对 T-test结果(n=10)

2.4 依达拉奉与谷氨酸诱导神经元释放 NO的关系 如表 1及图 1所示,Glu组、Glu+Eda组加药后 6 h后,NO浓度较对照组均显著升高(P＜0.01),为对比加入依达拉奉后谷氨酸诱导 NO释放有无影响,经单因素方差分析,Glu组 NO浓度较 Glu+Eda组升高更明显(P＜0.01),提示依达拉奉能减少 Glu诱导神经元释放 NO。加药后 24 h三组横向比较的结果与加药后 6 h的结果亦一致。

3 讨 论

3.1 谷氨酸与 NO在神经毒性作用中的相互关系 脑缺血预处理能引起一定程度的诱导型一氧化氮合酶(Indusible nitric oxide synthase,iNOS)表达增加[4],而谷氨酸受体阻断剂能阻断脑缺血预处理所引起的 iNOS表达增加,间接提示谷氨酸能诱导NO释放增加。谷氨酸注入大鼠侧脑室内可引起大脑皮质及海马内一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞增多[5],但缺乏直接证据证实谷氨酸能引起神经元释放 NO增加。本研究发现,加入 Glu 6 h及 24 h后,培养基中的 NO浓度明显升高(P＜0.01),提示 Glu能诱导体外培养神经元释放 NO。谷氨酸、NO作为神经递质参与体内众多的病理生理过程。众多研究表明,缺血缺氧时内源性的谷氨酸诱导的神经毒性作用对诱导神经细胞的凋亡发挥着重要作用。然而,NO在中枢神经系统中发挥着双刃剑的作用,一般认为病理生理过程中,早期释放的 NO有保护作用,但后期过多的 NO则有神经毒性作用。研究发现一氧化氮合酶抑制剂 AMDA(非对称性二甲基精氨酸)能显著地减弱谷氨酸对 PC12细胞的兴奋毒性作用,其作用机制可能与抑制 NOS活性,减少 NO生成有关[6]。结合本研究提示,谷氨酸损伤神经系统的作用途径之一可能为通过引起神经元释放 NO增加。

3.2 依达拉奉与 NO的关系 在非神经系统的研究中发现,依达拉奉能抑制经细胞因子刺激的肝细胞 iNOS基因的表达[7],同时能延迟大鼠睾丸缺血再灌注后 NO释放的峰值时间[8]。在神经系统的研究中发现,NO能引起细胞凋亡,但依达拉奉能减弱 NO供体硝普钠引起的星形胶质细胞凋亡[9]。Noor等[10]在新生Wistar大鼠缺血缺氧模型的研究中发现,依达拉奉可短暂地降低脑脊液内 NO的含量。上述研究提示在病理状态下,依达拉奉可降低NO的释放。

本研究发现,虽然 Glu组及 Glu+Eda组加药后6 h后 NO较对照组均有升高(P＜0.01),Glu组一氧化氮浓度较 Glu+Eda组升高更明显(P＜0.01),提示依达拉奉能减少 Glu诱导神经元释放 NO。脑缺血再灌注后可产生大量自由基,自由基的生成除造成细胞膜性结构受损外,还能引起谷氨酸等兴奋性氨基酸释放增加,而谷氨酸又可引起 NO释放增加。NO性质活跃,能迅速分解成自由基,如此恶性循环造成脑组织损伤。

综上所述,依达拉奉作为一种自由基清除剂,在脑部缺血缺氧时的保护作用,一方面能减少自由基的堆积,另一方面还可抑制 NO的过量生成。

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