治疗性结核病疫苗研究进展

沈洪波，王洪海

复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海 200433

结核病是由结核分枝杆菌引起的重大传染病，严重危害人类健康。目前全球大约有1/3人口感染了结核分枝杆菌，其中5%～10%转化成活动性结核病。近几年来，结核病的发病率和病死率持续增加[1]。多重耐药菌株的出现是近年来全球结核病疫情肆虐的主要原因之一[2-4]。针对多重耐药结核病的治疗非常困难，与治疗敏感菌感染引起的结核病相比，失败率要高80倍，且预示着多重耐药结核病有成为不治之症的危险[5]。目前直接监督下的短期化疗(directly observed treatment, short course，DOTS)方案治疗周期过长，且现有抗结核药物主要作用于生长活跃的结核分枝杆菌，不能有效杀死生长缓慢或处于休眠期的结核分枝杆菌，容易产生耐药菌株。因此，如何有效杀死胞内残存的结核分枝杆菌，预防结核病复发，以及有效治疗耐药结核分枝杆菌感染，是结核病研究面临的重大挑战。

疫苗接种可有效激发宿主针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应，有助于清除宿主体内残存和休眠期的结核分枝杆菌。传统的结核病疫苗主要用于疾病预防[6]。未来疫苗开发的目标包括研制针对潜伏感染的疫苗，抑制、清除潜伏感染的细菌，阻止结核病复发[7]；同时，要开发接种于已感染结核分枝杆菌(尤其是耐药结核分枝杆菌)个体的新型疫苗，配合化学抗结核药物的使用，彻底清除耐药的以及残留的结核分枝杆菌。

接种于已感染个体的疫苗，称为治疗性疫苗，是近年建立和发展起来的免疫治疗新概念[8]。1999年，Lowrie等在Nature报道了表达热休克蛋白60(heat-shock protein 60，Hsp60)的DNA疫苗，用于小鼠结核病治疗的研究[9]，进一步激发了学者们对治疗性结核病疫苗的研究兴趣。目前，治疗性结核病疫苗的研究已经取得了很大的进展。治疗性疫苗RUTI(无毒的结核分枝杆菌片段)已成功完成了临床Ⅰ期试验[10]。

1 治疗性结核病疫苗的作用机制

结核分枝杆菌的潜伏感染是结核病防治中的一大隐患。在潜伏感染者体内，结核分枝杆菌的复制变得非常缓慢或已经休眠，即结核分枝杆菌已适应了宿主的免疫环境，从快速生长状态转变到非复制的缓慢生长状态，抗原表达谱较快速生长状态时有显著差异。在目前的结核病化学治疗过程中，抗结核药物杀死了快速生长的结核分枝杆菌，却无法彻底清除生长缓慢的细菌，也造成部分细菌在宿主体内残留[11]。这些细菌生长缓慢或处于休眠状态，数目极少，产生的抗原量少，导致的炎症反应小，激起细胞免疫的能力有限，因此宿主免疫系统无法将其清除[12]。

宿主通过气溶胶感染结核分枝杆菌后，获得性免疫在肺部的诱导表达非常缓慢[13]。结核分枝杆菌存在于宿主肺部的肺泡组织(alveolar tissue)，生长缓慢，激起的肺泡组织免疫反应非常微弱。结核分枝杆菌感染树突细胞(dendritic cell，DC)后，降低DC激发T细胞的活性。感染的DC由肺移动到淋巴结大约需要14 d；T细胞激活后，DC转移到感染部位大约在感染后的15～18 d[13]。这样就给结核分枝杆菌提供了足够时间，扩增到一定数目，从而干涉宿主保护性免疫反应的有效表达，建立稳定的感染。获得性免疫虽然能控制细菌生长，但在细菌数目多到一定程度后，细菌生长就无法控制[13]。因此，免疫反应的慢启动对于疾病控制非常不利。

治疗性结核病疫苗的主要任务是诱导和增强以抗原为基础的细胞免疫反应，通过诱发抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答，杀死细胞内寄生的结核分枝杆菌。研究表明，Th1型为主的细胞免疫对抗结核分枝杆菌感染具有重要作用。DNA疫苗等治疗性疫苗能将低效的抑菌反应转换成高效的杀菌反应，让外源基因在真核细胞内表达，表达出的抗原能在细胞质中与主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子结合，然后被呈递到细胞表面。CD8+T细胞在识别含有抗原肽的MHCⅠ类分子后，产生可裂解细胞的效应分子。这些效应分子具有穿膜活性，如perforin和granulysin，由此降解靶细胞[14]。这些效应分子还能破坏宿主细胞内存活的结核分枝杆菌。CD8+T细胞也能产生Th1型的典型细胞因子[15]，促进调理作用抗体的产生。调理作用抗体有助于宿主细胞吞噬胞外结核分枝杆菌，从而阻断病原体从干酪样坏死部位向远距离组织扩散。

在治疗性疫苗中，卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)已无法发挥重要作用[13]。因为结核分枝杆菌感染阻止BCG的复制，BCG不能作为后感染疫苗提供保护。同样道理，许多活的全菌疫苗也不能提供有效的免疫保护。但是，亚单位疫苗仅表达少数重要抗原基因，其表达不会像BCG一样被阻止，并能激活重要抗原在感染个体中的免疫活性，诱导抗原特异性淋巴细胞发挥吞噬功能，且不会对宿主造成严重的免疫病理后果。

2 治疗性结核病疫苗

治疗性结核病疫苗的主要任务是激发宿主特异的保护性免疫反应，逆转发生在疾病进行中的非保护性免疫反应，使其向保护性Th1型反应发展，从而有助于清除潜伏的结核分枝杆菌，缩短传统的化学药物治疗疗程。为实现这一目的，目前的结核病疫苗的研究主要集中在以下几个方面。

2.1 基于结核分枝杆菌抗原的疫苗

结核分枝杆菌为了适应宿主体内的免疫环境，使早期表达的蛋白成为宿主免疫系统的诱骗(decoy)蛋白，因此只有在潜伏感染期首次表达的蛋白才是治疗性疫苗表达的重要抗原。目前，对诱导结核分枝杆菌休眠的条件及细菌对这些条件的反应还知之甚少。但有证据表明，控制细菌在动物模型中的复制需产生γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和一氧化氮。另外，模拟病原菌在肉芽肿内环境的条件，如缺铁、缺氧、缺营养等是最近几年集中研究的重点[7]。Wayne 等通过逐渐减少氧气，改变细菌的呼吸而产生硝酸还原作用，鉴定出可被厌氧诱导的与休眠相关的基因hspX(Rv2031)[16]。近年来全基因组芯片研究表明，厌氧条件下100多个基因的表达发生改变，其中DosR调节子包含48个基因，与hspX具有协同作用[17]。

蛋白质组学和基因芯片分析表明，在宿主体内结核分枝杆菌的许多脂代谢相关基因的转录发生了改变，如鼠肺内长期存活的结核分枝杆菌表达异柠檬酸裂合酶，这是一个脂肪酸代谢必需的酶。结核分枝杆菌在体内的代谢显著受宿主反应的影响，因为激活的巨噬细胞能更有效地剥夺细菌的营养，为了抵制吞噬体运输的改变，细菌关闭了脂肪酸的降解代谢途径[11]。这些研究的深入将为针对休眠菌的疫苗设计提供重要指导。

2.1.1结核分枝杆菌的分泌性抗原Ag85复合体包括3种蛋白成分——Ag85A、Ag85B和Ag85C，它们是主要的分泌性抗原，也是目前在结核病疫苗研究中最受关注的抗原。在Ag85A 抗原中，P242-250是MHCⅠ类限制性CD8+T细胞的识别位点，在抗结核病的保护性免疫中，CD8+T细胞也发挥重要作用。另一个重要蛋白质抗原ESAT6是早期分泌蛋白，其基因在BCG中缺失，具有多个CD4+和CD8+T细胞结合位点，可激活有效的体液免疫和细胞免疫。

2002年吴雪琼等用结核分枝杆菌H37Rv腹腔内注射感染BALB/c小鼠建立模型，发现DNA疫苗治疗组肺组织涂片细菌数和肺菌落计数均比对照组明显减少，证实Ag85A DNA疫苗具有一定的免疫治疗效果[18]。随后，吴雪琼等先后证实Ag85A、Ag85A/ESAT6嵌合型质粒DNA与药物联合使用能显著提高药物对耐药结核分枝杆菌感染的治疗效果[19，20]。

江山等[21]探讨了分别表达Ag85B、MPT64抗原的DNA疫苗对小鼠的治疗作用。通过检测器官载菌量以及脾淋巴细胞特异性IFN-γ、白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)、TNF-α的分泌水平等指标，结合相关组织病理变化，发现Ag85B DNA疫苗对小鼠结核病有一定的免疫治疗作用，可能通过增强宿主Thl型免疫反应，诱导TNF-α、IFN-γ共同升高而达到治疗目的。

2.1.2结核分枝杆菌的细胞内蛋白1999年，Lowrie等[9]首次将编码麻风分枝杆菌Hsp65的DNA疫苗用于小鼠结核病的治疗，显著降低了肺、脾中细菌数目。实验结果表明，DNA疫苗能将Th2型免疫反应向Th1型转换。2005年Nuermberger等[22]用Hsp65 DNA疫苗和药物化疗(利福平、莫西沙星)治疗结核潜伏感染的小鼠，发现Hsp65 DNA疫苗能增加莫西沙星的抗结核活性。Silva等[23]用Hsp65 DNA疫苗结合药物治疗BALB/c小鼠结核病，1个月就可显著减少肺和脾结核分枝杆菌载量，6个月后肺中未检测到结核分枝杆菌；同时还发现Hsp65结合药物治疗对结核分枝杆菌敏感株H37Rv和耐药株同样有效。

还有研究[24]表明，多肽与结核分枝杆菌家族的细菌蛋白融合表达对结核病有治疗作用。首选的多肽是结核分枝杆菌中低氧压引起的潜伏期上调表达的蛋白。融合多肽的组合包括ESAT-6、ESAT-6-Ag85B、TB10.4、CFP10、RD1-ORF5、RD1-ORF2、Rv1036、MPB64、MPT64、Ag85A、Ag85B(MPT59)、MPB59、Ag85C、19kDa 脂蛋白或MPT32。研究表明该疫苗既可用于治疗，也可用于预防结核病。

2.2 表达结核分枝杆菌抗原和细胞因子融合基因的疫苗

大量研究发现，结核分枝杆菌抗原与宿主来源细胞因子等编码基因的融合体显示较好的免疫效果。Okada等[25]融合表达了结核分枝杆菌 Hsp65与IL-12编码基因，采用日本红细胞凝聚病毒包膜和脂质体(Hsp65+IL-12/HVJ)为载体，在豚鼠结核分枝杆菌感染的治疗中，显著提高CD8+和CD4+T细胞的保护效率，减少耐药结核分枝杆菌的数目，提高耐药菌株感染豚鼠的存活率。在目前最好的结核病动物模型恒河猴中的研究表明，该疫苗表现出良好的治疗效果(包括存活率和免疫反应)。这些数据表明该疫苗可能对感染结核分枝杆菌(包括广泛耐药菌株和多重耐药菌株)的患者，具有治疗作用。

Andersen等[24]构建了一个DNA载体，以表达Hsp65与人IL-2融合基因，结果表明该疫苗提高了Th1型细胞免疫反应，产生大量IFN-γ和IL-2，激起高效价的抗Hsp65的抗原特异性IgG2a抗体。在用DNA疫苗治疗结核病小鼠的实验中，该疫苗能显著降低结核分枝杆菌的数目，提高Th1型反应[26]。

结核分枝杆菌Hsp70包含多个T细胞和B细胞表位，免疫原性较Hsp65更强，能诱导出特异性Th1型反应，对结核分枝杆菌的攻击可产生较强的保护性免疫效应。CD80(B7-1)是近年来发现的一种具有免疫活化功能的第二信号分子，与其共刺激受体CD28和(或)CTLA24 相互作用可提供T细胞活化所必需的协同刺激信号，对体液免疫和细胞免疫具有全面的活化作用。史小玲等用结核分枝杆菌强毒株攻击小鼠后，接种Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗，结果表明该疫苗具有较好的免疫治疗效果[27]。

2003年，Ha等[28]将Ag85A和IL-12N220L DNA疫苗联合异烟肼和吡嗪酰胺治疗C57BL/6J结核病小鼠，防止结核病复发的效果优于IL-12N220L DNA疫苗与药物联合治疗组，更优于单纯药物组。

2.3 其他类型

RUTI由脂质体包裹的结核分枝杆菌片段构成，脂质体由磷脂酰胆碱和胆碱钠组成[10]。在鼠类模型中，感染结核分枝杆菌9～17周后采用异烟肼和利福平治疗，并用RUTI 在17、19和21周进行免疫治疗，残留的结核分枝杆菌数目显著降低。在C57BL/6和DBA/2纯系小鼠模型中，RUTI能调节Th1/Th2反应的平衡。RUTI可在初期化疗后使用，那时细菌载量已极大降低，RUTI可加快破坏残留的细菌。在中止化疗的感染实验动物中，RUTI可显著降低细菌载量，其作用机制可能是在治疗动物肺内产生CD8+IFN-γ+T细胞；RUTI也能产生很强的抗体反应，对多种抗原肽产生IgG1、IgG2a和IgG3抗体。RUTI是针对潜伏结核分枝杆菌感染的治疗性疫苗，与药物化疗联合在治疗结核病小鼠和豚鼠模型中非常有效，不存在毒性[29,30]。

江山等[21]研究表明，IL-12质粒单独用于治疗小鼠结核病有一定作用。邵燕丽等[31]研究表明，IL-12、IL-18和IL-10都可用于免疫治疗，且IL-18用作疫苗佐剂可能优于IL-12。

日本科学家[32]发明了新型的治疗性结核病疫苗，即采用腺病毒载体表达IL-6相关基因(IL-6 gene + IL-6 receptor gene + gp130 gene)。IL-6相关的DNA疫苗具有显著的治疗效果，能激发CTL活性，减少组织病理性结核坏死。采用该疫苗治疗小鼠后，肺部结核分枝杆菌数目明显低于BCG东京株，而且针对结核分枝杆菌的CTL活性明显提高，肺部的组织病理学变化明显改善。另外，他们还采用质粒pcDLSR表达人源颗粒溶素cDNA，用该疫苗治疗后，小鼠肺、脾和肝组织中的结核分枝杆菌数目明显少于非治疗组。目前他们正在研究两者协同治疗的效果。

3 治疗性疫苗的载体及免疫策略

目前，治疗性结核病疫苗主要是以质粒为载体的DNA疫苗。随着基因治疗研究的深入及病毒载体应用研究的较大进展，病毒载体可在宿主体内长期、稳定地表达目的基因。

慢病毒载体具有能感染分裂和非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、基因持续表达、免疫反应小等特点，被广泛应用于癌症的治疗研究。基于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的慢病毒载体已成为基因治疗最有效的手段[33]。

腺病毒载体是非常有潜力的结核病疫苗载体，因为其具有定向性和强烈的CD8+T细胞刺激作用[34]。然而5型腺病毒在人群中高度流行，感染后的个体将产生中和抗体，会削弱其高流行区的疫苗效率。35型腺病毒是非流行株，所以具有较为广泛的用途。由于安全性高，重组腺病毒已被用作各种基因治疗的载体。腺病毒对呼吸道上皮细胞有天然的高亲和力，是呼吸道黏膜抗结核的理想载体。

电转染也是一种有效的治疗性疫苗的转染技术。李忠明等[35]采用施加方型波电脉冲、促进质粒DNA体内转染的方法，研究了电转染技术联合初次免疫后加强免疫的策略能否增强结核分枝杆菌核酸疫苗的免疫原性。3次初次免疫后，用相应抗原或BCG加强免疫，结果表明该策略能显著增强结核分枝杆菌核酸疫苗在动物体内的免疫原性。

4 结语

治疗性结核病疫苗的发展优势在于针对常规治疗无法彻底清除的潜伏期细菌和难以采用化学药物治疗的耐药菌株，防止疾病复发。治疗性疫苗可打破机体免疫耐受，调节机体免疫系统功能，增强机体特异性免疫反应，从而起到积极治疗作用；可逆转通常发生在疾病进展期的非保护性免疫反应，使其向Th1型反应发展，从而治愈肺结核或作为佐剂缩短传统的化学药物治疗的疗程。

结核病是慢性传染病，其生物学过程包括病原潜伏、免疫逃避机制或病原储备机制。治疗性疫苗的作用在于被接种后在宿主体内仍能有效激发免疫反应，但慢性感染患者通常表现为免疫防御受损。因此，真正的趋势应该是将化学药物与治疗性疫苗联合使用，优化在药物治疗过程中治疗性疫苗的接种时间、接种次数等。

在疫苗设计上，治疗性疫苗与传统意义上的预防性疫苗具有显著不同的特征。通常，预防性疫苗主要作用于从未感染的机体，因此天然结构的微生物蛋白可直接用作疫苗抗原。而治疗性疫苗的作用对象则是曾经感染的个体，天然结构的微生物蛋白一般难以诱导机体产生特异性免疫应答。但在多数微生物感染中，抗原呈递细胞已被感染，因此需要设计与常规感染过程不同的抗原加工与处理途径。治疗性疫苗必须经过分子设计和重新构建，以获得与原天然病毒蛋白结构类似、但又不同的新的免疫分子。

疫苗研制属高科技生物药物开发范畴。 美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)的报告显示，开发中的疫苗增长非常迅速，年增加品种达44%。国外权威专家预测，未来生物技术的“重磅炸弹”——生物药品将由治疗性疫苗等5类组成，因此研究与开发治疗性疫苗将具有重大的理论意义及潜在的巨大经济和社会效益，已经受到世界范围的广泛关注。

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