结核分枝杆菌进化与致病性的研究

董丹丹，高谦

复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

结核病是一种古老的疾病，但到目前为止，由于缺乏有效的疫苗，该病仍然是全球公共卫生的重大威胁，每年全球有超过200万人死于结核病[1]。近年来,结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染发病率不断上升。而多重耐药结核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)菌株尤其是广泛耐药结核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)菌株的出现和传播，为结核病的治疗带来了巨大困难。中国是全球22个结核病高负担国家之一[2]，2009年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)发布报告，2008年中国结核病发病100万～160万人，仅次于印度，居世界第2位。所以结核病的预防和控制在我国尤为重要。据估计，全球有1/3的人口已潜伏感染了结核分枝杆菌，但是只有5%～10%的感染者会发展为活动性肺结核病。发病原因尚不明确，可能与所感染菌株的毒力、菌量以及引发宿主的免疫应答密切相关。分子流行病学研究表明，一些特定基因型的菌株能在某些地区暴发流行。不仅细胞和动物实验显示这些菌株在毒力和引发宿主免疫应答方面具有优势，临床观察的结果也表明不同基因型的菌株具有不同的临床表型。因此研究结核分枝杆菌进化与致病性之间的关系能够为结核病的预防、控制和治疗提供重要的参考。

1 古老结核分枝杆菌的种系发生及进化

结核分枝杆菌是一种古老的细菌，与大多数细菌不同，其基因组序列极其保守，基因组的单核苷酸突变率仅为0.01%～0.03%[3]。而大肠埃希菌EDL933和MG1655的全基因组仅在基因组骨架上就有75 168个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)，突变率达1.8%[4]。目前还没有证据表明结核分枝杆菌具有基因水平转移现象[5]，而基因水平转移通常是造成细菌基因组遗传变异性的重要原因。然而，在长期进化过程中，结核分枝杆菌也必然积累一些遗传变异信息，如在基因组中存在与真核生物类似的重复单元区域，被认为是其遗传多样性的表现。

最近，Gutierrez等对结核分枝杆菌复合群的6个管家基因(katG、gyrB、gyrA、rpoB、hsp65和sodA)以及16S rRNA基因进行测序，研究菌株进化关系。结果发现与人类起源一样，结核分枝杆菌的起源可追溯到300万年前[6]的非洲大陆，古老的结核分枝杆菌曾在人类祖先中暴发流行，并伴随着人类的迁徙，分布到全世界的不同区域。这一发现引发出一个新的观点，即结核分枝杆菌的进化与人类的进化和迁徙密切相关。 在15 000～20 000年前，分枝杆菌经历了一个进化瓶颈[7]，古代的不同结核分枝杆菌几乎全部消失，仅其中一个分支保留下来，导致目前全球流行的菌株都是结核分枝杆菌的同一个分支，即所谓的现代菌株。长片段缺失分析发现，现代菌株基因组中具有TbD1的缺失。这种具有种群优势的结核分枝杆菌随着人类的迁徙走出非洲，逐渐传播到其他大陆，于是有了目前结核分枝杆菌各基因型在全球的不同分布[7]。

2 SNP是研究群体进化结构的有力工具

近年来，有很多研究致力于分析结核分枝杆菌的群体进化结构[5,6]，即运用各种基因型分型方法绘制出一幅详细的进化树，如间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)和长片段缺失分析[8]，特别是近年发展起来的SNP分型法分辨率更高，为研究菌株的进化关系提供了有力的工具。结核基因组上的SNP位点(SNP loci)可以是同义突变，也可以是导致氨基酸改变的非同义突变，这2类突变为研究细菌进化提供了极其有用的信息。一般来说，由于非同义突变引起氨基酸序列的改变，可能在内在或外部环境的选择压力下带来趋同进化的结果。如结核分枝杆菌的耐药往往与基因组上特定药物靶标的基因发生突变或缺失相关[9,10]，因此在耐药基因关键位点上的非同义突变可能改变菌株的耐药性。相反，同义突变不会带来氨基酸序列的改变，这种突变被视为中性。当同义突变发生在管家基因时，就成为研究菌株间遗传和进化关系的关键位点。所以SNP不仅能对结核分枝杆菌进行基因分型，也是研究种系发生的有力工具。

为了利用同义突变研究结核分枝杆菌的种系发生和进化，Sreevatsan 等首先运用katG和gyrA上的2个非同义突变位点，将现代结核分枝杆菌复合群划分为3个大的遗传群体(principle genetic group，PGG)：PGG1、PGG2和PGG3[11]。此后，Gutacker等应用来源于结核分枝杆菌复合群的230个同义突变分析不同地域来源的临床菌株，将结核分枝杆菌复合群分为8个家族：Ⅰ～Ⅷ。选出具有代表性的36个同义突变，对5 069个菌株进行分型，得到相似的进化结构，即同样的8个家族和1个新的家族ⅡA[12,13]。这9个家族与PGG之间有很好的对应关系，即PGG1包括家族Ⅰ、Ⅱ、ⅡA，PGG2包括家族Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，PGG3包括家族Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ。目前全基因组已测序完成的菌株H37Rv、CDC1551分别属于家族Ⅷ和Ⅴ，而在亚洲和北美地区流行的北京基因型菌株均属于家族Ⅱ。从全球的菌株分布来看，PGGI主要在亚洲、美国和非洲的一些地区流行，PGG2主要在南、北美洲和加勒比海地区流行，而PGG3在全球各地均有分布。

利用SNP来研究种系发生和进化，入选菌株的代表性及数量、SNP位点的代表性及数量决定了进化树的形状和分支程度。实际上，有目的地选择一些具代表性的同义突变位点能很好地揭示结核分枝杆菌的进化关系。更重要的是，由于SNP有较高和稳定的分辨率，人们能将基因型分型的结果联系菌株的生物学表型，如菌株的致病力，从而有希望为结核病的预防﹑控制﹑治疗和转归提供一定的指导。

3 从基因型到表型，从进化到毒力差异

研究发现，不同的临床菌株具有不同的致病性。目前在实验室中已建立用动物模型和细胞模型来鉴定菌株毒力的方法。在小鼠和豚鼠模型中，不同毒力的菌株主要表现为宿主的不同免疫应答及致死率，以及对药物治疗的不同敏感程度[14,15]。在巨噬细胞模型中，细菌的胞内繁殖速度、吞噬溶酶体成熟与否、细胞凋亡以及细胞因子的释放都是重要的检测指标。

分子流行病学研究证明，一些特异基因型的菌株能引起特异的生物学表型[16,17]，如Valway等报道曾经引起暴发流行的菌株CDC1551具有很高的传播力[18,19]。CDC1551一度被认为具有很高的致病性，因为对其感染人群进行皮肤测试时发现，纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)能引发很强的免疫反应，即大面积的皮肤红肿[18]。在小鼠实验中发现，与标准菌株H37Rv相比，CDC1551的毒力反而较弱。这一现象的合理解释在于CDC1551能诱发更强的早期免疫应答，如释放大量肿瘤坏死因子、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-10和IL-12。这些炎症因子的释放一方面可使人在PPD皮肤测试时表现为大面积皮肤红肿，另一方面在小鼠实验中使小鼠免疫应答加强，死亡率降低[20]。相反，有很多证据表明北京基因型菌株可能具有较高的毒力[21]。被北京基因型菌株(PGG1，cluster II)HN878感染的小鼠，因细胞因子释放减少及肺部载菌量剧增而迅速死亡。进一步研究发现，HN878偏向于诱导Th2型细胞因子释放[20,22]。与HN878具有相同基因型及在多个地区造成流行暴发的菌株210也被证实具有很强的致病性，其在巨噬细胞内的增殖速度是其他临床菌株的4～8倍[23,24]。

目前有很多研究致力于寻找各个进化分支上菌株的生物学表型差异[25,26]。如López等用动物模型比较全球流行的4种不同遗传背景的菌株，发现北京基因型菌株毒力最强，且能在一定程度上抑制宿主的免疫反应。检测巨噬细胞受细菌感染后释放的细胞因子发现，不同遗传背景的菌株诱导不同的细胞因子图谱[27,28]。Dormans 等从荷兰国立卫生研究院收集的8 000株具有IS6110分析信息的菌株中，挑选19株分属于11个基因型的菌株，分别感染小鼠，发现这些菌株的致病性及其引发的迟发型超敏反应都有显著差异[19]，说明不同的临床菌株在体外和体内模型中表现出的致病性和诱发宿主产生的免疫应答有显著差异。因此，未来结核分枝杆菌基因型的信息对临床治疗可能有很大的指导意义。

已经有一些临床治疗的数据支持这一观点。Thwaites等分析397株临床分离菌株及其引发的症状后发现，北京基因型菌株引起的结核性脑膜炎病程缩短，脑脊液中白细胞数量降低[29]，而欧美菌株感染与肺组织实变相关。这意味着不同的菌株基因型对疾病的进程及宿主的免疫应答有显著影响。van Crevel等曾报道，感染北京基因型菌株的患者在治疗初期出现短暂的体温升高[30]。这一差异可能是由于北京基因型菌株能诱导不同的宿主免疫反应；而在肝毒性和菌株耐药性方面，感染北京基因型菌株的患者与感染其他菌株的患者没有显著差异。如果能够将菌株的毒力差异与临床患者的症状，如病程发展速度与转归之间建立联系，那么鉴定菌株的基因型别将在临床治疗中发挥更大作用。目前，美国国立卫生院正在建立一个数据库，内容包括全美国临床分离的结核分枝杆菌的基因型、菌株耐药谱，以及患者的临床症状和转归等信息，作为治疗的参考数据，让医生能够对不同菌株引发的结核病进行针对性的用药和治疗。然而，仅目前的临床数据以及在动物和细胞水平对数量有限的菌株所做的研究结果，很难对菌株的进化与致病性的关系下结论，还有待进一步研究以提供更多的实验室和临床数据。

4 结语

目前，结核分枝杆菌基因型分型手段日趋丰富，结核分枝杆菌种系遗传关系逐渐被阐明，菌株基因型与生物学表型的关系越来越受到关注。运用高分辨率的分型法可更好地将菌株不同的遗传背景与其不同的毒力和致病力联系起来，研究特有基因型菌株的致病性和传播特征、高致病性菌株的种系发生和地理分布，对结核病的预防﹑控制及临床治疗有巨大意义。

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