血小板主要粘附受体在血小板凋亡及血栓形成负反馈机制中的作用

戴克胜

北京航空航天大学生物与医学工程学院血液与细胞生物学实验室,北京,100191

目的:血小板在血栓形成,尤其是动脉和微血管血栓形成过程中起主要作用。血小板表面主要粘附受体-膜糖蛋白(GP)Ibα与受损伤血管表面血管性血友病因子(vWF)的结合是血小板参与血栓形成、止血的起始、关键步骤。本研究的目的是探讨血小板主要粘附受体在血小板凋亡及血栓形成负反馈机制中的作用,并探讨其相关机制。方法:取健康志愿者外周抗凝静脉血,分离纯化血小板。通过瑞斯托霉素(Ristocetin)或剪切力作用诱导GPIbα与vWF特异性结合;采用流式细胞术、Western-blotting分别检测线粒体和胞质凋亡标志物、凋亡调控蛋白、Bax、Bak和Bcl-2的表达,以及血小板膜表面GPIbα的表达量以及GPIbαN端和C端的酶切情况。构建表达野生型GPIbα、突变型GPIbα-552(不含GPIb alpha-552氨基酸以后的C-末端序列)和GPIbα-609(609位丝氨酸被丙氨酸替代)CHO细胞株,Ristocetin诱导细胞与vWF的结合,用流式细胞术和Western-blotting检测凋亡标志物及凋亡调控蛋白的表达。结果:在Ristocetin和高剪切力作用下GPIbα和vWF结合可诱导血小板发生凋亡(包括线粒体内膜电位的降低、磷脂酰丝氨酸的外翻、骨架蛋白gelsolin的酶切),促凋亡蛋白Bax和Bak高表达以及GPIbα胞外部分酶切;而在生理性剪切力作用下,GPIbα和vWF结合只可诱导GPIbα的酶切,不能引起血小板凋亡反应。血小板活化抑制剂PGE1和apyrase不能抑制GPIbα/vWF诱导的血小板凋亡和GPIbα酶切。此外,在 Ristocetin作用下,与GPIbα野生型细胞株相比,两株突变型细胞株呈凋亡阴性。抑制GPIbα胞质结构域和信号蛋白14-3-3结合的多肽可显著抑制GPIbα和vWF结合诱导的血小板凋亡的发生。结论:在生理和病理条件下,血小板GPIbα与vWF的结合除了能够诱导血小板粘附、血栓形成以外,还可以诱导血小板凋亡和GPIbα酶切。凋亡过程受GPIbα胞质结构域和信号蛋白14-3-3结合的调控,这一发现为揭示血栓性血小板减少性紫癜(T TP)等疾病的发病机制提供了全新思路。而流体剪切力作用下GPIbα与vWF相互作用可导致GPIbα酶切的发现,提示血小板具有自身负反馈调节机制,可阻止血栓的无限制增大。以上发现对认识体内血栓形成与调控机制、探讨疾病发病机理以及新的预防治疗措施具有重要意义。