外源性硫化氢在脂多糖致老年大鼠急性肺损伤中的作用*

曹 华,周晓红,黄新莉,赵润生,凌亦凌,张雪静

河北医科大学基础课教学部病理学教研室石家庄 050091

#通讯作者,女,1970年5月生,博士,副教授,研究方向:肺的病理生理研究,E-mail:zzxxhh2007@sina.com

老年人易患肺部感染,进而引发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)。ALI的主要病变特点表现为急性弥漫性肺泡和肺血管损伤,最终可发展至急性呼吸窘迫综合征,病死率极高,具体发病机制不明。内源性气体信号分子如CO和NO在ALI中的作用已得到多方证实[1-3]。硫化氢(H2S)可能是继 NO和 CO之后发现的另一种气体信号分子[4],参与神经和血管的功能调节等多种生理和病理过程[5-7]。有学者[8]发现在离体器官水平H2S和NO共同参与了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的大鼠肺动脉反应性异常,进而推测老年大鼠ALI时,H2S和NO、CO之间可能存在某种联系。因此,作者制备LPS致老年大鼠ALI模型,观察ALI时肺组织损伤指标、H2S及其生成关键酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)、诱导型NO合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/NO和血红素加氧酶-1 (hemeoxygenase-1,HO-1)/CO体系的变化,探讨H2S在LPS致ALI中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌LPS(LPSE.coli O111:B4)、 NaHS、5'-磷酸吡哆醛、L-半胱氨酸、N,N-二甲基-对苯二胺硫酸盐、辅酶Ⅱ、6-磷酸葡萄糖和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、血红蛋白及血红素均购自Sigma公司;抗HO-1多克隆抗体和抗iNOS多克隆抗体购自武汉博士德公司;SP免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;NO与CO含量、iNOS与HO活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。

1.2 实验分组 清洁级健康雄性SD大鼠48只,20月龄,体质量 350～400 g,购自河北医科大学实验动物中心。自由摄食、饮水,室温 18～24℃,相对湿度40%～70%,每日 12 h光照维持,昼夜循环。大鼠适应性喂养 1周后,随机分为 3组,每组 16只。①对照组:气管内滴注生理盐水(200μL/只)。②LPS组:气管内滴注LPS(溶于生理盐水)200μg/只。③NaHS+LPS组:LPS滴注前10 min腹腔注射NaHS(溶于生理盐水)28μmol/kg。每组分别于LPS给药4及 8 h后,各取 8只进行取样观察。

1.3 标本制备 分别于滴注药物后 4、8 h从颈总动脉放血处死动物,取血浆检测NO、H2S和CO含量;称量全肺以测定肺系数;留取左侧肺叶下部,以体积分数 10%中性甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片,用以观察肺组织形态学变化及检测HO-1、iNOS蛋白表达的变化;取左侧肺叶中上部制备肺组织匀浆,用于检测CSE、iNOS及HO活性和MDA含量。

1.4 测定指标

1.4.1 肺系数测定 自气管分叉以上 5、6软骨环间剪断气管,用滤纸吸干肺表面血污后称质量。肺系数=全肺湿质量(g)/体质量(kg)。

1.4.2 肺组织形态学观察 光镜下观察肺组织形态结构变化。每组选取 6张切片,每张切片连续观察10个视野(×100),肺泡内含有2个以上红细胞和(或)中性粒细胞为损伤肺泡。计算损伤肺泡数占计数肺泡总数的百分比,即肺泡损伤数比值(IQA),作为肺损伤的组织学定量评价指标。

1.4.3 肺组织中MDA含量及CSE、iNOS活性的测定 采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。采用分光光度法测定肺组织iNOS活性,严格按试剂盒说明进行操作。参照文献[6]方法测定CSE活性。

1.4.4 肺组织中HO活性检测 取肺组织,加4倍体积PBS(0.1 mol/L,pH 7.4)制成匀浆,4℃、15 000 g离心15min,取上清液-70℃保存。反应体系含肺组织匀浆上清液20μL、血红素20μmol/L、NADP 0.8 mmol/L、肝组织匀浆上清液20μL(作为胆绿素还原酶的来源)、6-磷酸葡萄糖4 mmol/L和6-磷酸葡萄糖脱氢酶1 U。37℃暗处反应1 h,于冰上终止反应。以不含辅酶Ⅱ的样品作空白对照。用分光光度计于464和530 nm处测定吸光度。胆红素消光系数为40 mmol/(L·cm)。计算1mg HO蛋白1 h催化血红素降解生成胆红素的量,以此表示 HO活性。肺组织匀浆上清液蛋白测定采用考马斯亮蓝法。

1.4.5 血浆中H2S、NO及CO含量测定 采用去蛋白的分光光度法[5]测定 H2S,根据H2S标准曲线计算上清液中 H2S的含量。采用硝酸还原酶法间接测定 NO,严格按试剂盒说明进行操作。参照Chalmers等[9]的双波长分光光度法测定CO,以血浆中HbCO的百分比含量(%)代表CO含量。

1.4.6 肺组织中iNOS和HO-1蛋白检测 采用SP法检测大鼠肺组织iNOS、HO-1蛋白表达。切片常规脱蜡、脱水,一抗滴度为1:100,DAB显色,苏木素复染,脱水、透明并封片。以 PBS代替一抗作为阴性对照。细胞质染成棕黄色的即为阳性细胞。每鼠取 5张切片,每张切片取 3～5个高倍视野,用全自动图像分析系统检测阳性细胞的光密度值,计算 5张切片的平均值,作为iNOS、HO-1蛋白的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用SPSS 11.5进行统计分析。数据以¯x±s表示,3组间各指标的比较采用单因素方差分析,两两比较用SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠肺组织形态学的改变 光镜下(图1),对照组肺组织结构正常。LPS组肺泡间隔增厚、断裂,中性粒细胞浸润,肺泡内可见浆液、红细胞,且大鼠的肺损伤随时间的延长而加重。NaHS+LPS组肺组织病变较LPS组减轻,大部分肺组织接近正常,局部肺组织有少量炎性细胞浸润,肺泡隔略有增宽。3组IQA的比较见表1。

图1 3组大鼠肺组织形态学的变化(HE,×100)A:对照组;B:LPS组;C:NaHS+LPS组。

2.2 3组大鼠肺系数及肺组织MDA含量的比较见表1。可看出,LPS组肺系数及肺组织MDA含量均高于对照组和NaHS+LPS组,NaHS+LPS组又高于对照组。

2.3 3组大鼠肺组织中CSE、iNOS及HO活性的比较 见表2。

2.4 3组大鼠血浆H2S、NO及CO含量的比较 见表3。

2.5 3组大鼠肺组织中iNOS及HO-1蛋白的表达见图2和表4。对照组肺组织中偶见iNOS和HO-1阳性细胞。LPS组肺组织中 2者的表达较对照组增强,iNOS主要表达于肺泡间质的单核-巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及支气管上皮细胞,HO-1主要分布于气道上皮、肺泡壁、血管壁细胞和炎症细胞的胞质中。与LPS组比较,NaHS+ LPS组iNOS的表达减弱,HO-1的表达增加。

表1 3组大鼠肺组织IQA、肺系数及MDA含量测定结果(n=8)

表2 3组大鼠肺组织中CSE、iNOS及HO活性的比较(n=8)

表3 3组大鼠血浆H 2S、NO及CO含量的比较(n=8)

图2 3组大鼠肺组织中iNOS及HO-1蛋白的表达(SP,×400)A 1,A 2:对照组iNOS及HO-1的表达;B1,B2:LPS组iNOS及HO-1的表达;C1,C2:NaHS+LPS组iNOS及HO-1的表达。

表4 3组大鼠肺组织中iNOS及HO-1蛋白相对表达量的比较(n=8)

3 讨论

H2S具有多种生物学作用,如参与低氧性肺动脉高压和感染性休克[5-6]以及缓解自发性高血压血管重构等[7]。作者的实验结果显示,LPS引起老年大鼠肺组织损伤的同时,血浆 H2S含量和肺组织CSE活性下降;预先给予H2S供体NaHS可使H2S含量和 CSE活性升高,肺损伤也明显减轻。提示CSE/H2S体系的下调在LPS致ALI中有一定作用,而给予一定量的外源性 H2S对肺组织有保护作用。作者检测了老年大鼠肺组织中 MDA含量,证明外源性H2S可一定程度上减少ALI时肺内MDA的生成,提示H2S具有一定的抗氧化作用,H2S具有清除活性氧的作用[10]。

NO是最早发现的气体信号分子,可参与多种肺疾病的发生[11]。NOS是合成NO的关键酶,iNOS诱导产生的过量NO具有细胞毒性作用[12]。CO具有抗炎、抗氧化等作用。机体内源性CO主要由HO催化血红素降解产生,诱导型HO(即HO-1)可作为保护性蛋白被细菌内毒素、炎性细胞因子及NO等多种因素诱导表达[13]。作者发现,LPS致老年大鼠ALI的同时,使肺组织中H2S减少,上调iNOS/NO体系和HO-1/CO体系,前者是LPS致损伤的机制之一,后者则可能是机体对抗损伤的一种保护性反应。给予NaHS可下调iNOS/NO、上调HO-1/CO。由此推测,ALI时 3种气体信号分子间可能存在相互调节,具体机制尚待进一步研究。

总之,实验结果表明,CSE/H2S体系的下调参与了LPS所致老年大鼠ALI的发病,而外源性H2S可通过本身的抗氧化作用以及下调iNOS/NO体系、上调HO-1/CO体系发挥一定的抗损伤作用。

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