十味胆宁胶囊的质量标准研究

刘丰林,张进朝,胡素英

(1.开封市中医院,河南开封 475001;2.开封市第二中医院,河南开封 475001)

十味胆宁胶囊由金钱草、黄芩、黄连、柴胡、玄明粉、羚羊角粉、甘草、甘姜等十味中药组成,功效为清热解毒、软坚散结,主要用于胆结石、胆囊炎的治疗,是开封市中医院获得河南省食品药品监督管理局制剂批文的院内制剂(豫药制字Z04020115),临床疗效确切。以其所立的市级课题“胆宁胶囊治疗胆石症临床研究”于 1996年获开封市科学技术进步二等奖。但十味胆宁胶囊存在服用量大的缺陷,其生产工艺需要进行改革,由于原质量标准无鉴别和含量测定项,因此不能满足生产工艺改革后的质量控制。为了更有效地控制其质量,提高其质量标准,参考 2005版《中国药典》(一部),对方中主要药味金钱草、黄芩、柴胡拟定了薄层鉴别,同时用高效液相色谱法对金钱草中所含的槲皮素、山奈素进行了含量测定,以期为该制剂的新生产工艺提供质量控制依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 药材及对照品

十味胆宁胶囊,根据处方由开封市中医院制剂室自制,批号 080507,080812,090309。对照品:槲皮素 (110766-200816)、山奈素 (110766-200816)、柴胡皂苷a对照品 (110766-200816)、柴胡皂苷d对照品(10766-200816)、柴胡对照药材(110766-200816)、黄芩苷对照品 (110737-200812)、黄芩对照药材(110766-200816),均购买自中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与试剂

日本岛津高效液相色谱仪,包括岛津 LC-10ATvp泵、SPD-10Avp型紫外检测器CTO-10Avp型柱温箱及CBM-2Avp型色谱工作站,均为岛津仪器(苏州)有限公司产品。AS3120A超声清洗仪,天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品。薄层层析展开槽,开封百纺化玻有限公司提供。硅胶薄层板:羧甲基纤维素钠、硅胶 G薄层板(5 cm× 10 cm),购自青岛海洋化工集团公司。甲醇(一级色谱纯),天津市四友精细化学品有限公司产品,产品批号 090822;其余试剂均为分析纯,为天津化学试剂六厂产品。

2 质量标准

2.1 薄层鉴别

2.1.1 柴胡的TCL鉴别

取本品8粒,加甲醇20 mL,超声处理10 min,滤过,滤液浓缩至 5m L,滤过,滤液作为供试品溶液。另取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品,加甲醇制成每1毫升各含0.5 mg的混合溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》附录ⅥB)实验,吸取上述两种溶液各5μL,分别点于同一硅胶 G薄层板上,以醋酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,60℃加热至斑点显色清晰,分别置日光及紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点或黄色荧光斑点。

2.1.2 黄芩的TCL鉴别

取本品6粒,加甲醇20 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取黄芩对照药材 1 g,同法制成对照药材溶液。再取黄芩苷对照品,加甲醇制成每 1毫升含1mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》附录ⅥB)实验,吸取上述 3种溶液各5μL,分别点于同一以含 4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶 G薄层板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂,预平衡30min,展开,取出,晾干,喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;在与对照品色谱相应的位置上,显一相同的暗绿色斑点。

2.1.3 金钱草的TCL鉴别

取本品6粒,加80%甲醇20mL,超声处理20min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL使溶解,用乙醚提取2次,每次10mL,弃去乙醚液,水液加稀盐酸10mL使溶解,水浴加热1h,迅速冷却,用乙酸乙酯提取2次,每次10mL,合并乙酸乙酯液,用水30mL洗涤,弃去水洗液,乙酸乙酯液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取槲皮素、山奈素对照品,加甲醇制成每1毫升含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》附录ⅥB)实验,吸取上述供试品溶液5μL,对照品溶液各2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 3%三氯化铝乙醇溶液。在105℃下加热5min,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显一相同颜色的荧光斑点。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适应性实验

填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶;流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)),0.45μm微孔滤膜滤过,用前超声脱气;检测波长为 360 nm;柱温30℃;流速1.0m L/min。

在此色谱条件下,测得槲皮素、山奈素对照品贮备液和供试品溶液色谱图。可见槲皮素峰的保留时间约为20.2 min(见图1),山柰素峰的保留时间约为36.1min(见图2);两峰与相邻峰分离度均大于1.5,理论塔板数分别为 3 700和 6 229。

图1 槲皮素对照品色谱图

图2 山柰素对照品色谱图

3.2 对照品溶液的制备

参照文献[1],精密称取槲皮素对照品及山柰素对照品适量,加 80%甲醇制成为每 1毫升各含槲皮素3.89μg、山柰素19.45μg的溶液。

3.3 供试品溶液的制备

参照文献[1],取本品 5粒内容物,混匀,研细,过3号筛,精密称取 2 g,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇50mL,密塞,称定重量,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用 80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25 mL,精密加入盐酸5mL,置90℃水浴中加热水解 1 h,取出,迅速冷却,转移至50m L量瓶中,用 80%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

3.4 阴性对照品溶液的制备

取缺金钱草的模拟制剂等量,按供试品溶液的制备方法制备。

3.5 测定法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,以峰面积按外标法计算。

3.6 线性关系考察

精密吸取浓度为3.89μg/mL的槲皮素对照品溶液 4,8,12,16,20μL,注入液相色谱仪,测定峰面积积分值,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,进行线性回归,方程为:Y=1.36×103X+20.655。精密吸取浓度为 19.45μg/m L的山柰素对照品溶液,同法测定,得方程为:Y=31.8×103X+15.72。结果表明:槲皮素在6～80μg间,浓度与峰面积积分值呈良好线性关系;山柰素在 10.8～154.4μg间,浓度与峰面积积分值呈良好线性关系。

3.7 精密度实验

精密吸取上述对照品溶液 10μL,重复进样5次,按上述色谱条件测定,槲皮素和山柰素峰面积积分值的RSD分别为0.60%和0.91%,见表1和表2。

表1 槲皮素精密度实验结果

表2 山柰素精密度实验结果

3.8 稳定性实验

取同一批号的供试品溶液(批号 080507),每隔2 h进样1次(10μL),共进样6次,按上述色谱条件分别测定。结果槲皮素和山柰素的RSD,分别为1.64%和1.23%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

3.9 重复性实验

取同一批号的样品5份(批号 080507),按供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液(n=5),照3.1项下的色谱条件测定结果,槲皮素平均含量为46.68μg,RSD为 0.63%;山柰素平均含量为31.12μg,RSD为1.20%。

3.10 加样回收率实验

取已知含量的样品(批号080507)内容物适量,精密称定,分别精密加入槲皮素对照品溶液(3.89μg/mL)30.0 mL和山奈素对照品溶液(19.45μg/mL)4.0 mL,按照供试品溶液制备项下的方法制备,依法测定,计算回收率。结果见表 3～4。

表3 槲皮素回收率测定结果

表4 山柰素回收率测定结果

3.11 样品含量测定

取 3批样品,按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,槲皮素、山柰素含量测定结果见表 5。

表5 3批样品槲皮素含量测定结果

表6 3批样品山柰素含量测定结果

3.12 空白实验

取处方量除金钱草外其余各药味,制成阴性样品,按含量测定方法实验。

结果表明:阴性样品的HPLC图谱中,未呈现与金钱草对照品保留时间相同的色谱峰,表明阴性对照无干扰。见图 3和图 4。

4 讨 论

十味胆宁胶囊薄层色谱鉴别均作了阴性对照实验,结果表明:各薄层斑点不受样品中的其他药的干扰。专属性强,简单易行,可作为本品定性检测的指标。

金钱草为十味胆宁胶囊组方中君药,具有清利湿热、清肝利胆、退黄的作用,将其所含槲皮素、山柰素作为定量指标对其制剂质量的控制具有重要的意义。

本实验样品溶液的制备是参照2005年版《中国药典》(一部)金钱草含量测定项下供试品溶液制备的方法,因本样品为片剂,故回流 1 h,经实验证明该法提取效果较好,干扰成分较少。

实验中以文献[1]提供的色谱条件为基础,通过实验摸索,制剂中各组分能够实现较好的分离,证明该条件适合该制剂的含量测定。

本文建立的方法简便,专属性及重复好,结果准确可靠,可用于该制剂的质量控制与分析。

[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:198,152,331-332.