USP对无菌检验隔离器验证的技术要求

高海燕 丁恩峰 赵丽雅 张文英

(1. 石药集团恩必普药业有限公司；2. 英国施达化学集团公司中国代表处，河北石家庄 050031)

无菌药品制造是涉及多学科、多工种的复杂制药技术。其中，无菌检测是评估产品是否符合无菌要求的关键手段。由于检测条件的限制和人员操作技术的欠缺，无菌检查结果的准确性受到很多质疑。Isolator技术是国际上流行的无菌检测保障手段，对于确保无菌检测结果的准确性具有重要意义。

在19世纪80年代中期，人类就开始使用隔离器（isolator）来建立一个无菌检验工作环境。隔离器可以通过密封的方法或者采用过滤除菌空气保持正压的方法，创造一个无菌的环境。当隔离器处于密闭状态时，仅仅能够在隔离器内部或者通过一个特殊的快速传递仓来传递物品；当隔离器打开时，允许通过一个特殊设计并经过验证的可避免污染物进入的开口递出物品。隔离器一般采用柔软的塑料（例如：聚氯乙烯）、硬塑料、玻璃或不锈钢来制造。

由于隔离器（isolator）系统从根本上避免了分析人员与物品的直接接触，因此在无菌检验时可以避免被检验物品和辅助设备被污染。当隔离器内部与外部环境完全隔离时，隔离器内部的物品是在无菌条件下进行传递的。操作者穿着半身衣在隔离器内部进行无菌操作。半身衣是连接在隔离器墙体上的柔软的部分，隔离器内部有足够的空间允许操作者穿着半身衣在隔离器内部进行操作；当然，操作者也可以通过连接在隔离器璧体上的袖子和手套进行操作。在使用隔离器的情况下，不要求操作者穿着特殊的洁净服进行操作，操作者穿着标准的实验室服装进行操作就足够了。为确保隔离器内部无菌，一般使用杀孢子化学试剂对隔离器内部灭菌来杀死全部活的生物。

1 隔离器的类别和使用范围

隔离器系统（Isolator system）是无菌制药领域的关键设备。隔离器系统最早从二十世纪八十年代开始使用以来，逐渐完善和发展。在近十年中，获得长足技术进步。在2002年5月，USP微生物方面的开放会议中，仅有两项无菌技术被冠予“高级的（advanced）”名号来进行讨论：隔离器技术（Isolator technology）和吹-填-封技术（Blow-fill-seal technology）。由此可见，隔离器技术在无菌制药领域的地位。

目前，在无菌制药领域中，主要有如下几种隔离器在使用，分别是无菌取样隔离器、无菌分装隔离器，无菌检验隔离器等。随着隔离器技术的发展和完善，这项技术必将在无菌制药行业的更多环节使用。另外，在和制药行业相关的教学环节和科研环节，隔离器也在逐渐被采用。图1展示了隔离器的目前使用情况和发展前景。

图1 隔离器在医药工业中的应用和发展

2 隔离器的结构和设计

2.1 空气处理系统

用于无菌检验的隔离器需要配备除菌过滤器（要求使用HEPA）。静态时，要求隔离器内部尘埃粒子项目符合美国联邦标准209E的100级空气质量要求。动态时，不要求隔离器内部符合100级空气质量要求，也不要求隔离器内部的空气流速或者换气次数达到某标准。隔离器系统是能够防止泄漏的，然而，它不是通常意义上的防止隔离器与外界环境进行空气交换。当与外界环境直接相连的门打开时，隔离器内部的正压保证隔离器内部的无菌环境不被污染。用于无菌检验的隔离器内部空气流可以是单向流或者湍流。

2.2 传递接口及传递门

隔离器有一个附属的“传递通路”杀菌器，通过传输通道杀菌器可以直接将无菌的培养基、无菌的稀释液、无菌的装备等传递进隔离器系统。一般设计成快速传递仓或门（RTP=rapid transfer port），通过快速传递仓或门可以把两个隔离器彼此相连，无菌的物品就能够从一个隔离器传递到另一个隔离器。通过快速传递仓，两个隔离器或者一个隔离器和一个容器就可以在普通环境中连接。通过密封圈或法兰，将传递仓的非无菌表面连接。用垫圈压紧来保证气密性，避免微生物进入。

当两个传递仓法兰连接形成一个密封通道时，存在一个狭长的垫圈带，这个部位可能存在微生物污染。因此一旦连接完，在使用传递仓传递物品之前，必须立即用杀孢子杀菌剂对垫圈暴露部分进行处理。并且在传递物品时，应当注意无菌操作技巧的运用，避免物品或手套接触垫圈表面。

将垫圈装配在法兰上时，应当按照传递仓生产商的建议进行预防性的维护和润滑。传递仓垫圈应当按照生产商建议的要求定期更换并且定期检查，破损的垫圈不能够保证真正的密封。

3 隔离器安装位置的选择

用于无菌检验的隔离器不需要安装在洁净区，但是安装在一个限制非授权人员进入的区域仍然是重要的。安装时，应当使隔离器周围有足够的空间，以便于移动隔离器，传递物料，以及通常的维护。隔离器所在的房间不要求进行环境监测。

隔离器房间温度和湿度对于操作者的安全和舒适是重要的，温湿度对于除菌和净化技术的影响效果也很关键。如果隔离器位于空气补给口的气流通道中，当隔离器采用蒸汽灭菌时，空气气流会使隔离器个别部位温度较低形成冷凝水。当采用对温度敏感的灭菌方法时，隔离器所处房间的温度应当是均一的。

4 隔离器和传统洁净技术的比较

无菌隔离器系统和传统洁净技术比较，具有明显的优势。请参见下表：

无菌隔离系统与传统洁净技术的对比

当然，采用无菌隔离器系统进行无菌生产和无菌检验，首次固定资产投资较大，在验证投入和技术维护方面需要较大精力和资金。

5 隔离器系统的验证

无菌检验合格与否是产品放行的前提，在进行无菌检验之前，隔离器系统的验证必须完成。为了核实隔离器及其辅助设备能够用于进行无菌检验，隔离器系统的验证可以分成三个部分：安装确认（IQ）、运行确认（OQ）、性能确认（PQ）。在无菌检验隔离器系统验证过程中，应当考虑到下面建议：在验证程序中，对特定阶段（例如：IQ、OQ、PQ）而言，测试功能项目在那个阶段进行就不是关键的。只要在隔离器用于检测前，隔离器的功能已经被验证并且有书面记录就可以了。

5.1 安装确认（IQ）

IQ阶段包括隔离器系统详细的外观描述，例如：隔离器尺寸、内部结构、所用的材料。关于接触面和传递系统，要清晰的画图并标注尺寸。设计的隔离器是否符合使用的规格需要被核实，例如：空气补给、真空、外部排气、温湿度控制功能等。其他与隔离器系统一起使用的设备也要详细描述；任何设计规格的修订都应当详细描述。设备指南和复印件应当编成目录并保存，在需要的时候，操作者可以得到并重新查阅。一旦设计规格符合性被确认，所有的图纸、方法和设备图要编成目录，完善保存并能够重新得到。

所有的文档应重新被审阅，便于核实能够反映出安装系统的关键属性要求。这样就建立了符合隔离器系统设计规格和安装要求的技术基础。

在故障模式下或高风险情况下进行分析时，可能导致试验失败的潜在的过程控制问题和设备问题可能被发现，这些问题应当进行核实并记录在文件中。如果有必要，系统可以被修改以便将失败的风险降到最低点，并且应该建立关键点的控制方法。

IQ 的结果应进行汇总形成报告，报告应包括以下内容：

设备：设备应符合设计规格并被列表记录。IQ报告应核实：符合设计规格的设备被接收，并且按照生产厂商的要求进行安装。

结构材质：隔离器系统关键部位的结构材质经检测是符合设计要求的。应该核实隔离器材质的杀菌方法兼容性。

仪表：系统仪表按照它们实际的校验状态来列表记录。

设施标准：所有操作功能，例如：在操作手册、流程、仪器图表中指明的功能，都应当被核实能够执行并且符合规格要求。隔离器系统和其他系统的所有连接部分应进行审核，其功能应被核实并符合设计要求。

过滤器：HEPA过滤器和其他微生物截留过滤器的测试和证书应该存档；测试结果和证书复印件应包括在IQ报告中。核对采购合同，核实空气过滤系统是否符合规格要求。

计算机软件：所有的和隔离器系统有关系的计算机软件列出名称、规格、文档版本号码。计算机系统盘被检查是否贴签并安全保存。

5.2 运行确认（OQ）

运行确认阶段将验证隔离器系统的运行是否符合设计的功能要求。

运行性能检查：这个试验核实所有的警报和警报的功能是否符合说明书要求。系统所有设置点和可调整的参数都应当被核实是否符合规定的要求。

隔离器完整性检测：在通常的操作条件下，隔离器应保持完整性。在隔离器装载物品并使用化学杀菌剂灭菌前，一个泄露试验可以证明隔离器符合厂家说明书要求并且是安全的。为了避免外界污染，隔离器通常在20-50Pa正压下进行操作。如果隔离器系统要求一个恒定的正压，验证过程中必须核实：操作时的压力设置值能够维持恒定的正压并且可以控制压力数值。

灭菌周期确认：执行一个灭菌周期，以便核实操作的实际数值与灭菌周期的各个步骤情况和设置数值一致性。

可以采用几种不同的灭菌方法来杀死隔离器和辅助系统的微生物。可以用于隔离器灭菌的化学试剂包括：过氧乙酸、二氧化氯、臭氧、过氧化氢，不同的试剂有不同的使用条件和过程控制要求。选定的灭菌方法应符合厂家的操作要求，并且在使用规程中对这些方法进行详细描述是十分关键的。使用过氧化氢蒸汽灭菌时，隔离器房间的温度和湿度的控制是关键的。隔离器内部的温度也是重要的，尤其对使用过氧化氢蒸汽灭菌过程中的影响是非常重要的，关键在于保持过氧化氢的浓度，避免低于过氧化氢的冷凝点。一些化学试剂，例如二氧化氯和臭氧，要求在灭菌前预先增加隔离器的湿度。如果采用对湿度有较高的要求的灭菌方法，在OQ中，隔离器系统控制湿度的能力必须被核实。

灭菌剂的浓度和浓度分布情况也是重要的。当灭菌剂以气态或蒸汽状态存在时，它的浓度可以通过化学指示剂、光谱方法或电子传感器检测。灭菌剂分布情况也可以使用化学指示剂测量。

采用灭菌剂在气态或蒸汽的状态下进行灭菌时，要求隔离器内部使用风机来均匀分布灭菌剂。风机的位置和方向可以进行调节以保证适宜的气流分布。由于架子、设备、手套、袖子装置和半身衣等能够影响气流分配模式，必须对隔离器满载状态下的气流分布进行检测；对物品的摆放情况进行详细描述并以书面形式记录。图2就是OQ末期满载状态下对isolator进行灭菌检测的情况。

图2 在OQ过程中对隔离器进行灭菌检测的状况

有时使用较小的传递隔离器作为便携式表面灭菌器，待验物品和辅助用具通过传递仓进入隔离器之前，这些物品和用具在便携式表面隔离器中进行化学灭菌。在OQ过程中，应制定出便携式表面灭菌器中物品和用具的摆放情况，审核摆放图并记录在OQ上。应该注意：化学灭菌剂作用在设备表面，因此，一些被遮盖的设备表面能够残留微生物并存活。

当达到杀菌剂作用时间后，可以使用通过除菌装置的新鲜空气或其他方式处理过的新鲜空气将杀菌剂从隔离器中移走。通过一个向外开放的通道，气体通过排风口排入大气；或者通过一个密闭的通道，在通道中使用一个杀菌装置移走并破坏灭菌剂。如果使用一个向外开放的排风通道，排放系统的气流和安全性应当被检测。

灭菌周期的研究—当OQ完成后，进行灭菌周期的研究以便建立日常灭菌控制过程必要的参数。一些普遍使用在工业中的无菌工艺验证的方法是可行的，例如：控制生物负荷量和过度杀灭法。灭菌工艺应该进行生物指示剂挑战试验。生物指示剂的孢子数和耐热性是已知的。应该尽量获得生物指示剂真实的D值，从生物指示剂供应商处获得D值是可以接受的。如果不可能获得准确的D值，同时无法获得灭菌剂浓度时，可以使用半灭菌周期的方法对灭菌周期进行研究和确认。

5.3 性能确认（PQ）

性能确认（PQ）是核实隔离器系统的功能是否符合操作者的要求。PQ过程完成后，如果可能的话，灭菌周期的有效性和排出口的灭菌剂应该被检测。所有的PQ过程的数据应该被统计，分析和存档。

清洁确认—在通常情况下，对于无菌检验来说，清洁不是关键的，但是，残留的产品可能会对检验有影响，有杀菌效果产品的残留对检验结果的影响尤其显著，在检测低水平污染时，这些残留的物质会对检测产生影响。由于粉末容易扩散，杀菌性粉末产品的残留对检验结果的影响是重要的。对于无菌检验隔离器系统和操作者的要求来说，没有肉眼可见污染这种清洗水平是合适的。清洁方法、周期、设备和清洁隔离器中所用的材料应该记录在文件中。

无菌验证—隔离器内表面、隔离器内的设备、拿进隔离器的各种物料都应当去除微生物。隔离器表面、无菌检验设备、检验物品的灭菌和产品接触部位或者产品药物成分接触部位的灭菌是不同的。隔离器灭菌可以用过度灭菌的log降低值来评估。如果超过灭菌周期，无菌保证水平不再被确定。隔离器灭菌操作完成之后，通过空气过滤系统的维持，良好的物品传递技术的采用，更重要的是，经过无菌处理的隔离器手套完整性的保持，隔离器的无菌性可以被保证。

通过阴性分数法或者过度杀灭法可以证实用于隔离器、试验物品、无菌检验用设备的灭菌方法可以使某种合适的、高抗性的生物指示剂来证实。过度杀灭分析法应该采用每单位104孢子数的生物指示剂，而阴性分数法应该采用每单位孢子数大于等于105的生物指示剂。使用足够数量的生物指示剂进行试验可以从统计学上证明灭菌效果是可以再现的以及灭菌剂的分布是合适的。隔离器内设备和物品满载时，需要用更多的指示剂进行试验。因此，没有一个或者更多的足够量的传感器来测量杀菌剂的浓度时，增加生物指示剂的放置是可以考虑的。在连续三次灭菌试验中，六个log降的杀菌能力试验结果可以证明灭菌有效性。

操作者应该建立隔离器再次灭菌的周期。这个周期可以是短短的几天，也可以是几周的时间，建立的依据是隔离器系统的无菌保持能力。

6 物料包装完整性确认

一些材料对杀菌剂有影响，这些材料能抑制微生物的生长。我们关注的是杀菌剂在产品包装上的穿透能力，在一些辅助设施，例如：过滤装置和管道的穿透力、在一些能够和产品、培养基、无菌试验的稀释剂接触的材料上的穿透力。在灭菌过程中，操作者有责任核实包装物、培养基、辅助物品在被批准使用的灭菌过程中没有受到影响。带旋转帽的管状容器、胶塞密封的小瓶、卷曲的褶皱已经被证明能够降低杀菌剂的穿透力。金属箔包装并且密封的容器能够防止杀菌剂的进入；然而，这些情况也能够导致一些表面不被灭菌。

在多数情况下，在进行无菌检验之前，操作者使用杀菌剂处理产品包装表面来减少进入隔离器物品的生物负荷量。操作者有责任通过验证证明：使用杀菌剂处理产品包装这个过程，存在于产品内部的低水平的微生物污染没有受到杀菌剂的影响，不会影响到检验的检出限度。建议用化学和微生物试验来检测包装物对污染的抵制能力。经过隔离器全部的灭菌过程后，杀菌剂对于细菌和真菌的抑制情况的验证需要进行。对于医疗装置的包装、药品的包装和密封系统包装的要求都是一致的。

验证研究可以确定，不论无菌检验用培养基还是环境控制用的培养基，是否符合在无菌检验时的需氧菌、厌氧菌、真菌的生长促进试验。

7 隔离器内部无菌环境的维持

在一个无菌周期内，隔离器系统保持内部环境无菌的能力必须被验证。隔离器系统出现故障或者隔离器内部的偶然污染情况下的微生物必须被检测。微生物检测通常包括一个例行的取样程序，它可以包括这样的时间点，例如：灭菌后的第一天和无菌保持期的最后一天。验证方法：就是放置在隔离器中的培养基被证明是无菌的。

隔离器内部可以使用接触碟监控规则表面，或者使用棉签擦拭监控不规则表面。然而，因为培养基残留会使隔离器产生染菌的风险，因此，这些检测最好在检测周期快结束时进行。如果环境监控和检测同时进行，而且有培养基残留，要细心地从隔离器内部清理干净。空气取样和沉降菌检测可以使用，但它们在检测隔离器内部非常低水平的污染时不是很灵敏。

最可能污染的途径是检验用具和样品进入隔离器的过程。验证所有进入隔离器内部的物品是无菌的是关键的，也应当定期检查垫圈，确保其完整，避免微生物的进入。手套和半身衣是另一个可能产生污染的来源。因为操作者戴着手套处理无菌检验物品，所以手套是应当特别关注的，手套上微小的破损很难检查出来，手套在使用时，在拉伸情况下，手套上微小的破损可以体现出来。特别注意：培养基接触法检测手指菌落的方法，在检测低水平的污染时灵敏度是不足的。用0.1%的蛋白胨水溶液浸泡手套，将溶液过滤，然后将滤膜放在生长培养基碟子上检测，这个方法可以检测出其他方法检测不出的泄露。

隔离器内部进行连续的尘埃粒子检测是理想情况，这样可以快速检测到过滤器的泄露。第二个选择是使用便携式的尘埃粒子检测器进行周期检测。尘埃粒子检测取样不能对隔离器内部的无菌环境产生风险。

8 无菌检测结果的解释

如果人员没有直接接触工作区，验证过的传输通道没有破损，隔离器内部微生物被杀死并有一个高的无菌保证水平，那么，无菌检验中的假阳性是很难出现的。然而，隔离器是一种机械装置，好的无菌操作技术仍然是必须的。如果出现阳性结果，只有根据USP<71>《无菌检验检测和调查》进行彻底调查，才能得出阳性结果无效这样的结论。

9 人员培训和安全要求

因为无菌检验操作在洁净室进行，需要对操作者进行关于隔离器专门程序培训。所有的培训记录和操作者操作的评估应有一个单独的记录并且存档。对所有进行操作或者维护隔离器的人员进行必要的安全培训是必须的。

人员使用杀菌剂的安全性必须被评估。使用杀菌剂的最近区域，应该保存原材料的安全数据或者一个类似安全数据文件供使用参考。贮藏和安全方面的预防措施应当符合规定。在隔离器使用之前，应该对隔离器和所有连接的通道安全进行检查。

[1] USP<1208>《Sterility Testing—Validation of Isolator Systems》.

[2] USP<1116> 《Microbiological evaluation of clean rooms and other Environments》.

[3] UK《 Isolators for the aseptic preparation of Pharmaceuticals》.

[4] PIC/S recommendations to the inspectors for《Isolators used for aseptic processing and sterility testing》.

[5] PDA TR 34《Design and Validation of Isolator Systems for the manufacturing and testing of Health care Products》.