DNA条形码技术在法医昆虫学中的研究进展

尹晓宏,王江峰

(广东警官学院,广东 广州 510232)

DNA条形码技术在法医昆虫学中的研究进展

尹晓宏,王江峰

(广东警官学院,广东 广州 510232)

嗜尸性昆虫的准确鉴定是应用昆虫判断死亡时间的先决条件,但是昆虫的鉴定只有相关类群的昆虫专家能够鉴定。DNA条形码 (DNA Barcoding)技术是利用一个或少数几个 DNA片段对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新技术。这一技术给生物分类研究带来了空前的繁荣,同时也给法医昆虫学中各昆虫种类的鉴别研究带来新的动力。

物种鉴定;法医昆虫学;DNA条形码;mtCO I

DNA条形码 (DNA barcoding)技术是利用一个或少数几个DNA片段对地球上现有物种进行识别和鉴定[1]的一项新技术,为近年来进展最迅速的学科前沿之一。DNA条形码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术,它代表了生物分类学研究的一个新方向[2],其已经引起了越来越多的生物学家的关注。

2002年 Tautz等[3]基于分子生物学和网络技术的发展,提出 DNA分类 (DNA taxonomy),以DNA序列为主体构建 DNA分类平台,对生物进行鉴定分类。2003年 Hebert等[4]人首先提出 “DNA条形码”概念,建议利用线粒体 CO I的特定区段来做DNA条形码的基础,期待给所有生物种进行编码。截至 2010年 3月,在DNA条形码数据库中已经收录了来自 68,231种生物的 810,237条序列。

1.DNA条形码技术的原理及操作步骤

DNA Barcoding产生的基础就是现代商品零售业 条形编码系统——UniversalProduct Code(UPC),它一般是使用 11个数字进行排列组合,则共有 1011种排列方式,每种排列对应一种商品,这样来区别各种各样的商品[5]。例如,一个长度600bp的蛋白质编码基因的核苷酸片段在第三密码子位点含有 200个核苷酸,这些位点上发生的替代经常都是中性选择,并且突变大多是通过随机漂变在种群中固定下来。假设在一组物种中第三位点的核苷酸全部是AT或全部是 GC,即在其 200多个位点上只有两种可能的核苷酸,那么就仅第三密码子位点的变化而言能够产生 2200或 1060的可能序列[6]。如此大数目的可能序列为 DNA条形码技术进行众多生物的物种鉴定提供了一个最基本的条件[7]。

DNA条形码以传统的DNA序列标记技术为基础,其在概念上与基因分型类似,并与系统发育和分类学研究有一定的关联。简单来说,即通过对一组来自不同生物个体的短的同源DNA序列进行 PCR扩增和测序,随后对测得的序列进行多重序列比对和聚类分析,从而将某个体精确定位到一个已描述过的分类群中。DNA Barcoding的基本操作过程包括以下几个步骤:提取 DNA、利用通用引物 PCR扩增目的片断、纯化 PCR产物、测序以及序列分析。

理想的DNA条形码应该符合以下几个标准:(1)在种间有明显的遗传变异和分化,同时种内变异足够小; (2)片段足够短,便于一个反应完成测序工作,而且便于 DNA提取和 PCR扩增,尤其是对存在 DNA降解的材料 (如:保存已久的昆虫干标本);(3)存在保守区域,便于设计通用引物。经过筛选,PaulHebert[8]最终选定了 CO I中一段约 645个碱基长度的片断。因为 CO I在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增,而且目前研究表明,其 DNA序列本身很少存在插人和缺失(即使有少数也主要分布于该基因的3’端,对结果的分析不会造成很大的影响)。同时,它还拥有蛋白编码基因所共有的特征,即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响,可以自由变异。

2.DNA条形码技术在国内外的研究进展

近年来,DNA条形码 (DNA barcode)技术在国外得到了迅速的发展和应用,在国外,Hebert等选取 COⅠ基因的一段序列对动物中的 7个门、8个目的不同种群及鳞翅目的 200个种进行种类鉴定,发现无论在门、目,还是在近缘种水平,该基因都具有较好的鉴定能力,并且称 DNA条形编码的准确率可达 99.9999%。2004年 Hebert[9]领导的研究小组对北美 260种鸟类进行了 DNA条形编码的序列分析;同年 Hebert[10]通过研究发现被认为同属 1个种类的 2 500多只哥斯达黎加普通蝴蝶分别属于 10个不同的种类,而这些蝴蝶的成虫单靠形态学特征无法区分,最后结合其颜色和食物偏好的不同,将这些蝴蝶分成 10个不同的类群。2005年 Robert等[11]人利用线粒体 CO I基因 655bp大小的区域对澳大利亚主要的 207种海鱼 DNA条形码种类研究,并得到满意的结果。2007年 Kelly等[12]使用线粒体DNA对美国西海岸及墨西哥西海岸的鬃毛石鳖进行条形码分类研究;Kevin等[13]人对加拿大及北美的部分鸟类进行了 DNA条形码分类研究;2009年 Vargas[14]等人对巴西的海龟种类进行了DNA分类研究,上述国外研究者均得到有价值的研究结果,近两年来国外相关的研究比较多,本文就不一一罗列。

在我国,从 2004年肖金花等[2]人开始关注该项技术始,近几年来很多的学者对 DNA条形码及其在相关学科的应用的可行性进行了综述[5,7,15-19],并且越来越多的研究者利用该技术进行相关领域的种类研究,最早于 2006年潘程莹等[20]报道了DNA条形码在斑腿蝗科七种蝗虫种类鉴别中的应用;随后 2007年高玉时[21]等对我国 6个地方鸡种的线粒体 CO I基因的DNA条形码进行研究,认为 CO I基因的 Bar1序列更适合地方鸡品种鉴定。2008年,徐向明[22]对我国 3个地方品种鸭线粒体 DNA CO I基因的 DNA条形码进行初步分析,共测定了 3个品种共 83个个体的鸭线粒体CO I基因,发现 13个单倍型,共 9种单倍型为 3个品种独有;同年张金梅等[23]人为澄清芍药属牡丹组物种问题,基于叶绿体基因组 ndhF,rps16-trnQ,trnL-F和 trnS-G 4个基因的 DNA序列进行DNA条形码分析,认为应用DNA条形码的类群应先进行系统发育分析,DNA条形码应至少来自两个独立的基因组,位点总数应该达到可靠鉴别目前已知物种所需的最小数目。2009年我国有很多研究者对其相关领域的种类进行了DNA条形码技术应用研究,包括蔡延森等[24]人对我国 8种猛禽的DNA条形码技术研究;范京安等[25]人的基于微型DNA条形码的果实蝇物种鉴定;冯毅等[26]人的DNA条形码芯片快速鉴定花蓟马;彭居俐等[27]人在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的 DNA条形码应用研究;陈庆等[28]对北京地区 7种常见嗜尸性蝇类CO I基因 DNA条形码的建立;屠云洁等[29]对我国 3个地方鸡种线粒体 DN A COⅠ基因条形码遗传多样性的研究。上述我国研究者对各物种的DNA条形码研究主要使用的是线粒体 CO I基因(除植物物种外),使用这一技术可以让非专业人员在很短时间内准确、经济地对目标物种进行鉴定和区分,大大提高了与物种鉴定有关的学科如分子生态学、法医昆虫学和农业科学等的应用效率和实用价值。

3.DNA条形码技术在法医昆虫学的应用

在昆虫分类中,DNA条形编码可以帮助昆虫分类学者鉴定在传统分类方法尤其是形态学上难以区分的虫种,甚至虫卵和幼虫,还能很快鉴定新种。这不仅帮助昆虫分类学走出当前的困境,而且为积累更多的分类学知识提供一个新的平台,为生物多样性研究提供新的推动力。法医昆虫学主要利用尸体上出现的昆虫特别是蝇类的生长发育规律判断死亡时间。在现实案例中,成蝇产卵后常飞离尸体或不好收集,最常收集到的是大量的卵、幼虫、蛹或蛹壳,甚至可能是一些残缺的昆虫的肢体。而各种不同的蝇类幼虫和蛹的形态非常相似,难以鉴别,为了鉴别其种类我们不得不将幼虫收集回来孵养使其长成成蝇,这样,势必延迟了若干天,以至若干周。与此同时,由于喂养的温度和湿度等环境因素及取食条件的变化,幼虫常常死亡而难以鉴定其种类判断尸体的死亡时间,从而阻碍案件的侦破。上述各种法医昆虫学中遇到的昆虫种类鉴别的难题随着 DNA检测和分析技术的飞速发展迎刃而解,应用各种分子手段对具有法医学重要意义的昆虫 (尤其是嗜尸性蝇类)进行种属鉴定的研究已经比较多,如RFLP、AFLP、DNA测序及分子系统发育分析等技术在法医昆虫学中的应用[30-35]。

由于线粒体DNA CO I基因可变位点信息基本遍布 CO I基因的整个区段,186bp序列比对分析与全序列给出的区分一致[33],所以不同引物设计得到的部分区段不论长短均可以和长序列进行比较,从而实现有关物种的区分和鉴定。DNA条形码技术在世界上很多物种的种类鉴定中均表现突出,基于线粒体 DNA CO I基因序列的 DNA条形码技术,在国内外许多杂志的报道中被证实能对很多生物物种进行高效区分。而线粒体 DNA上的CO I基因也是法医昆虫学研究的首选分子材料,故其基于线粒体 DNA CO I基因序列的 DNA条形码技术将也是进行法医昆虫学中种类研究的较佳选择,将能大大降低法医昆虫种类的法医鉴定中的应用难度。我国陈庆等[28]人 2009年首次将该技术应用于法医昆虫学,对北京地区 7种常见嗜尸性蝇类的种类鉴定进行研究,其对线粒体 DNA上CO I基因 1076bp大小的序列进行分析,不同地点采集的不同种类嗜尸性蝇类个体得到了成功的区分,序列信息的聚集结果和形态学鉴定的种类归属完全一致。因该技术在我国近两年来才刚刚发展起来,故应用于法医昆虫学方面的报道较少,大量的基础工作有待我们各个地区的法医昆虫学研究者去完成,逐步建立各个地区的嗜尸性昆虫的DNA条形码基础数据库,为后续实际应用打基础。

目前分子生物学技术在法医昆虫学方面的应用已经比较普遍,DNA条形码的基本操作过程也较易实现,对其他生物线粒体DNA CO I基因的研究为在法医昆虫上的应用提供了参考,生物信息学的发展使序列分析也变得简单易行。因此,将该技术应用于法医昆虫学的种类分析是可行的。

4.存在的争议和发展趋势

DNA作为分子标记使用的可行性及其在分支系统学和生物进化研究领域的实用价值已为大量的分子系统发育研究所证实,其不仅使得各种来源的生物标本得以充分利用,同时还可提高物种鉴定和编目的效率。但许多系统学研究者仍对此持批评态度:一方面,有人担心该行为可能会破坏传统的生物系统学研究而使其转变为一种服务性产业;另一方面,分类学家往往对单个基因序列能否足以作为物种鉴定的指标表示怀疑,认为其至多只能将某个体鉴定到种的水平。值得肯定的是,单基因分析对于研究者增进对物种遗传变异及其分类地位之间关系的理解是很有意义的,CO I基因被广泛作为DNA条形码使用的主要原因即在于其编码的氨基酸序列受到严格的约束,该特点使得通用引物的设计变得非常方便,但由于信息含量较少的缘故,也在一定程度上限制了其在更深层次系统发育水平的分辨能力。

尽管还存在争议但 DNA条形码已经在动物中得到广泛应用,在法医昆虫学中的研究也正在快速开展,这将有助于非昆虫分类学专业的法医工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定。DNA条形码不能取代传统的分类学,但作为数字信息DNA序列,其准确性、丰富性以及独一无二的可重复性将使该技术成为分类学家有用的工具。毫无疑问,DNA条形编码是大势所趋,不可阻挡。但我们必须突破单分子标记的局限性,要尝试多个分子标记的结合使用,而且在选取除 CO I之外的基因时,也决不能仅仅局限于现行通用的分子标记,要大胆尝试一些新的有潜力解决间题的基因,比如物种形成基因可能是区分近缘物种的重要分子标记。随着生物技术的发展,测序反应将会更快速、更便宜,有利于构建更完整的公共序列数据库,最终将使 DNA条形码这一快捷、高效的技术越来越实用。

目前我国在法医昆虫学中利用 DNA条形编码进行物种鉴定的报道非常少,我们应该积极参与到这项工作中,充分利用我国丰富的生物资源,促进DNA条形编码工作的进行,为构建一个强大的DNA分类学平台贡献我们应有的力量。

[1]KressW J,Wurdack K J,Zimmer E A,Weigt L A and Janzen D H.Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,2005,102(23):8369-8374.

[2]肖金花,肖晖,黄大卫.生物分类学的新动向 -DNA条形编码 [J].动物学报,2004,50(5):852-855.

[3]Tautz D,Arctander P,Minelli A,Thomas RH,Vogler AP.DNA points theway ahead in taxonomy[J].Nature,2002:418-479.

[4]Hebert PDN,Cywinska A,Ball SL,deWaard JR.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc.R.Soc.Lond.B,2003a,270(1512):313-321.

[5]王鑫,黄兵.DNA条形编码技术在动物分类中的研究进展 [J].生物技术通报,2006,(4)∶67-72.

[6]Stoeckle M.Taxonomy,DNA,and the barcode of life[J].Bio-science,2003,53(9):2-3.

[7]彭居俐,王绪桢,何舜平.DNA条形码技术的研究进展及其应用 [J],水生生物学报,2008,32 (6):916-919.

[8]Hebert PDN,Ratnasingham S,deWaard JR.Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit1 divergences among closely related species[J].Proc.R.Soc.Lond.B(Suppl.),2003b,270:S96-S99.

[9]Hebert PDN,StoeckleMY,Zemlak TS,et al.Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biol,2004,2(10):1657-1663.

[10]Hebert PDN,Penton EH,Burns JM,et al.Ten species in one:DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterflyAstraptes fulgerator[J].Proc NatlAcad SciUSA,2004,101(41):14812-14817.

[11]RobertD.Ward,Tyler S.Zemlak,Bronwyn H.Innes,Peter R.Last,PaulD.N.Hebert.DNA barcodingAustralia’s fish species[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2005,360(1462):1847-1857.

[12]Ryan P.Kelly,Indra Neil Sarkar,Douglas J.Eernisse and Rob Desalle.DNA barcoding using chitons(genus Mopalia)[J].Molecular EcologyNotes,2007,7:177-183.

[13]Kevin C.R.Kerr,Mark Y.Stoeckle,Carla J.Dove,Lee A.Weigt,CharlesM.Francis and PaulD.N.Hebert.Comprehensive DNA barcode coverage of North A-merican birds[J].Mol EcolNotes,2007,7(4):535-543.

[14]SarahM.Vargas,Flávia C.F.Araújo and Fabrício R.Santos.DNA barcoding of Brazilian sea turtles(Testudines)[J].Genet.Mol.Biol.,2009,(3):608-612.

[15]王剑锋,乔格侠.DNA条形编码在蚜虫类昆虫中的应用 [J].动物分类学报,2007,32(1)∶153-159.

[16]陈士林,等.基于 DNA barcoding(条形码)技术的中药材鉴定 [J].世界科学技术 -中医药现代化,2007,9(3):7-12.

[17]宁淑萍,颜海飞,郝刚,葛学军.植物 DNA条形码研究进展 [J].生物多样性,2008,16(5):417-425.

[18]陈念付晓燕 赵树进 韩丽萍.DNA条形码:物种分类和鉴定技术 [J].生物技术通讯,2008,19(4):629-631.

[19]陈念,赵树进.入侵种的 DNA条形码鉴定 [J].生物技术通讯,2009,20(1):135-137.

[20]潘程莹,胡婧,张霞,黄原.斑腿蝗科 Catantopidae七种蝗虫线粒体 CO I基因的 DNA条形码研究 [J].昆虫分类学报,2006,28(2):103-110.

[21]高玉时,等.6个地方鸡种线粒体 COⅠ基因的 DNA条形码 [J].农业生物技术学报,2007,15(06):924-930.

[22]徐向明.我国 3个地方品种鸭线粒体 DNA CO I基因的DNA条形码初步分析 [J].畜牧与兽医,2008,40(11):51-53.

[23]张金梅,王建秀,夏涛,周世良.基于系统发育分析的DNA条形码技术在澄清芍药属牡丹组物种问题中的应用 [J].中国科学 C辑:生命科学,2008,38(12):1166-1176.

[24]蔡延森,等.我国 8种猛禽的 DNA条形码技术研究[J].四川动物,2009,28(3):334-340.

[25]范京安,等.DNA条形码识别Ⅵ:基于微型 DNA条形码的果实蝇物种鉴定 [J].应用与环境生物学报,2009,15(2):215-219.

[26]冯毅,等.基于 CO I序列快速鉴定花蓟马的DNA条形码芯片初探 [J].生物技术通报,2009, (8):169-173.

[27]彭居俐,王绪桢,何舜平.基于线粒体 CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用[J].水生生物学报,2009,(2):271-276.

[28]陈庆,等.北京地区 7种常见嗜尸性蝇类的 CO I基因序列分析及 DNA条形码的建立 [J].昆虫学报,2009,52(2):202-209.

[29]屠云洁,等.3个地方鸡种线粒体 DN A COⅠ基因条形码遗传多样性研究 [J].家畜生态学报,2009,30(1):16-19.

[30]Sperling FA,Anderson GS,Hickey DA.A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation[J].J.Foren.Sci.,1994,39(2):418-427.

[31]Kakouli-Duarte T,Casey DG,Burnell AM.Development of a diagnosticDNA probe for the fruit fliesCeratitis capitata and Ceratitis rosa(Diptera:Tephritidae)using amplified fragment-length polymorphis m [J].J.Econ.Entomol.,2001,94(4):989-997.

[32]Amendt J,Krettek R,Zehner R.Forensic entomology[J].Naturwissenschaften,2004,91(2):51-65.

[33]Cai JF,et al.Sequencing of mitochondrial DNA cytochrome oxidase subunitⅠfor identification of sarcosaphagous flies(Diptera)in Chengdu[J].Acta Entomologica Sinica,2005a,48(1):101 -106.[蔡继峰,等.成都地区四种食尸性蝇类 m tDNA中 COl基因序列检测 [J].昆虫学报,2005,48 (1):101-106.]

[34]孙晓明,等.16SrDNA序列分析在嗜尸性蝇类鉴定中的应用 [J].法医学杂志,2006,22(1):36-38.

[35]王江峰,尹晓宏,陈玉川.五种常见嗜尸性蝇类的分子鉴定 [J].昆虫学报,2007,50 (4):423-428.

责任编辑:韩 静

A bstract:DNA bar coding technology is a new kind of technology using one or severalDNA segments to identify and appraise the current species in the world.This technology has led to great prosperity to the study of biological classification and meantimemotivated the study of insect species appraisal in forensic entomology.Thispaper has conducted a review of the theory and practice ofDNA bar code technology and its status quo and development in China and in the world and discussed the feasibility of using such technology in forensic entomology and the problems thatmay appear in its application.

Key w ords:species appraisal;forensic entomology;DNA bar code;mtCO I

The Research Development of DNA Bar Code Technology in Forensic Entomology

Y in Xiao-hongWang Jiang-feng
(Guangdong Police College,Guangzhou 510232,China)

D919

A

1009-3745(2010)02-0097-05

2010-01-28

国家自然科学基金“高度腐败及白骨化尸体死亡时间推断的昆虫学途径研究”(O30870332);公安部应用创新项目mtDNA

尹晓宏 (1977-),女,山西柳林人,硕士,广东警官学院实验教学管理中心实验员,从事法医物证及法医昆虫分子系统学研究;王江峰 (1970-),男,陕西富平人,广东警官学院教授,博士后,从事法医昆虫学及死亡时间推断研究。