质谱技术在中药小分子与生物大分子相互作用研究中的应用

王兆伏,宋凤瑞,刘志强,刘淑莹

(1.中国科学院长春应用化学研究所质谱中心,吉林长春 130022; 2.中国科学院研究生院,北京 100039)

质谱技术在中药小分子与生物大分子相互作用研究中的应用

王兆伏1,2,宋凤瑞1,刘志强1,刘淑莹1

(1.中国科学院长春应用化学研究所质谱中心,吉林长春 130022; 2.中国科学院研究生院,北京 100039)

中药发挥药理作用具有多组分,多靶点的重要特点。研究中药化学成分与生物大分子之间的相互作用不仅能够为阐明中药发挥药理作用的机理和物质基础提供科学依据,而且能够为新药设计提供理论指导。软电离质谱技术,尤其是电喷雾质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)在一定条件下能够使药物与生物大分子形成的复合物完整地转移到气相中并被检测到,在中药小分子与生物大分子相互作用的研究中具有很大的优势。同时,色谱-质谱联用技术在中药复杂体系与生物大分子相互作用的研究中也显示出很大的应用潜力。本文介绍了质谱技术在药物与生物大分子相互作用研究中的应用原理,并总结了近年来软电离质谱技术在中药小分子与生物大分子相互作用研究中的应用。

中药小分子;生物大分子;软电离质谱;相互作用

中医药是我国几千年来实证经验的积累,是我国劳动人民防治疾病的重要手段。然而,作为经验医学,中药具有与生俱来的不足,许多中药发挥药理作用的机理和物质基础尚不清楚。因此,阐明中药发挥药效作用的机理和物质基础是揭示中药的科学内涵,推动中药现代化和创新药物研究的必经途径[1]。

大量研究表明,中草药与西药发挥药理作用在本质上是一致的,主要途径都是某种(或某些)药物分子在体内与疾病相关的生物大分子相互作用,影响和改变后者的生物学功能,进而产生相应的药理效应,达到防治疾病的目的。然而,中药成分具有多样性和复杂性等特点,其发挥药效往往是多个活性成分作用于不同的生物靶分子的共同结果[1-2]。因此,以生物活性为导向,研究中药化学成分与生物大分子之间的相互作用对于阐明中药发挥药效作用的机理和物质基础具有重要的理论意义。同时,将与疾病相关的生物大分子作为药物靶标,可以极大地加快新药的开发速度,为研制中药新药提供一条简捷而有效的途径。

质谱技术具有快速、灵敏、准确、专一等特点,已逐渐成为中药现代化进程中的重要分析工具,在中药化学成分分析、中药质量控制、中药代谢产物鉴定和中药药物动力学研究等多个方面发挥着重要作用[3]。同时,软电离质谱由于其离子化条件温和,在中药小分子与生物大分子相互作用的研究中也具有很大的应用潜力。利用软电离质谱技术可以直接得到药物与生物大分子相互作用的化学计量比,计算二者之间的结合强度、确定药物的结合位点、以及获得反应动力学等多方面的信息[4-10]。此外,质谱还能方便地与多种色谱技术联用,非常适用于研究复杂体系中各种化学成分与生物大分子之间的相互作用[11]。

利用质谱技术研究药物与生物大分子的相互作用主要有两种策略[4]:一种是直接检测复合物的存在,并通过复合物的相对丰度比较药物与生物大分子的相对作用强度;另一种则是通过考察药物浓度(或物质的量)在加入生物大分子前后的变化来推断药物与生物大分子的相对作用强度。本工作总结了国内外近年来的研究结果,综述了软电离质谱技术,尤其是电喷雾质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)在中药小分子与生物大分子相互作用研究中的应用。

1 电喷雾质谱在中药小分子与生物大分子相互作用研究中的应用

ESI-MS电离过程非常温和,能够在接近天然溶液的状态下将药物与生物大分子形成的复合物从液相转变为气相而进行测定,非常真实地反映样品分子在溶液中的聚集状态,是研究中药小分子与生物大分子相互作用的理想分析工具。

1.1 中药小分子与核酸的相互作用

核酸是许多抗病毒,抗菌,抗肿瘤药物在体内作用的靶点。药物能够通过与核酸结合改变其结构,进而干扰疾病相关基因的复制与转录,阻碍蛋白质的合成,达到抗病毒、抗菌及抗肿瘤的作用。因此,研究中药小分子与核酸之间的相互作用不仅有助于从分子水平上理解药物的作用机制,而且可以为抗病药物的设计提供理论指导。

Chen等[12-13]利用 ESI-MS研究了原小檗碱类生物碱与双链DNA之间的相互作用,并基于小檗碱的结构合成了一系列衍生物,其中的一些衍生物与DNA具有较强的结合力,并在体外实验中被证实具有很强的抗肿瘤活性[14]。Dong等[15-16]研究了 5种双β-咔啉类生物碱与双链DNA之间的相互作用,结果表明药物结构中连接臂的长度可以影响其与DNA作用的强度,连接臂过短或过长都会削弱生物碱与DNA分子的结合能力。Bai等[17]利用 ESI-MS研究了白屈菜红碱以及血根碱与一系列发夹结构DNA之间的相互作用,结果表明这两种生物碱与含有一个嘧啶突起结构的发夹DNA分子具有较强的结合能力,且血根碱与DNA的作用力要强于白屈菜红碱,而后者的序列选择性则要高于前者。Guittat等[18]研究了白叶藤碱和新白叶藤碱与不同序列以及结构的DNA之间的相互作用,结果发现这两种生物碱与三链DNA分子的结合能力最强。Li等[19]利用 ESI-MS研究了大豆素与双链DNA和四链DNA的作用,结果表明大豆素对四链DNA具有较强的结合力,实验结果也通过光谱学方法得到了证实。近年来,本小组选取了具有抗病毒、抗肿瘤疗效的中药化学成分(包括生物碱、黄酮以及皂苷等),利用ESIMS系统地研究了这些中药小分子与单链[20-24]、双链[25-26]以及三链[27]DNA分子之间的相互作用,比较了不同中药化学成分与DNA靶分子之间的相对结合强度,阐明了这些中药成分的构效关系。通过考察复合物的碎裂规律以及对比正、负离子电喷雾质谱图,推断出小檗碱、药根碱、巴马汀与DNA靶分子的作用方式为嵌入结合[25]。进一步的研究表明,原小檗碱类生物碱与核酸分子中的鸟苷具有较强的结合力[21]。

此外,冷喷雾电离(coldspray ionization, CSI)作为在ESI离子源的基础上改进开发出的新型软电离技术[28],在研究药物与生物大分子相互作用方面也具有良好的应用前景。Kuzuhara等[29]利用CSI-MS研究了绿茶提取物中的没食子酰表没食子儿茶素(EGCG)与单链DNA,单链RNA以及双链DNA之间的相互作用,结果表明 EGCG结构中的没食子酰基和儿茶酚基对EGCG与核酸分子的结合都有贡献。

1.2 中药小分子与蛋白质的相互作用

蛋白质也是药物在体内发挥药理作用的主要靶点。药物可以通过与离子通道、酶等受体蛋白相结合,改变受体蛋白的空间构象或与受体蛋白的天然配体竞争结合,调节和改变受体蛋白的生物学功能,进而发挥其药效作用。此外,血浆蛋白(如血清白蛋白和α1-酸性糖蛋白)还是药物在体内的主要载体。药物可以通过与血浆蛋白结合,被运送到其发挥药效作用的组织和器官,同时药物与血浆蛋白的结合也可以有效地控制药物的释放、避免药物迅速代谢。因此,研究中药小分子与蛋白质的相互作用不仅有助于从分子水平上理解药物发挥药理作用的机制,还能对药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄进行充分的评价。

张华蓉等[30-31]利用 ESI-MS研究了人参皂苷Rb1、Rb2、Rd和Re与细胞色素c之间的相互作用,并计算得到了复合物的结合常数。Qu等[32]的研究表明,人参皂苷Rg1与溶菌酶的结合力要强于人参皂苷Re。陈晓岚等[33-37]对中药黄酮成分杨梅素、大豆素以及7-羟基黄酮进行了磷酰化修饰,并利用ESI-MS比较了黄酮成分及其磷酰化衍生物与蛋白质之间的相互作用,结果表明磷酰化黄酮与蛋白质的结合要强于黄酮,体外实验也证明前者对肿瘤细胞的抑制活性要强于后者[38]。陈勇教授课题组成员[39-44]通过ESI-MS研究了5种中药小分子(包括小檗碱、莨菪烷类生物碱、射干苷、葛根素、七叶皂苷钠)与人血清白蛋白(HSA)以及α1-酸性糖蛋白(AGG)之间的相互作用,并通过滴定法得到了药物与蛋白质的化学计量比、结合常数、以及作用力的类型。最近,Liu等[45]利用ESI-MS研究了丹参酮IIA对抗凝药物华法林与 HSA作用的影响,研究表明,丹参酮IIA能够与华法林竞争性地结合HSA,其结果可以导致血液中游离的华法林药物浓度升高,进而加速华法林的代谢,这一研究成果有助于从分子水平阐明丹参酮IIA在体内加强华法林药理作用的原因。

此外,电喷雾傅里叶离子回旋共振质谱(ESI-FT-ICR MS)技术还能够用于研究复杂体系与蛋白质的相互作用[46]。Vu等[47]利用 ESIFT-ICR MS分别研究了85种植物甲醇提取物与碳酸酐酶的相互作用,从中筛选出一种与碳酸酐酶特异性结合的抑制剂 6-(1S-hydroxy-3-methylbutyl)-7-methoxy-2H-chromen-2-one(香豆素的水解产物)。

需要指出的是,由于某些蛋白质的相对分子质量很大,常常选择蛋白质的某些功能结构域作为靶分子,研究药物小分子与蛋白质的相互作用。Benkestock等[48]选取 HSA的第II结构域作为药物受体,通过竞争反应得出了未知药物与HSA的结合位点。此外,由于许多含有Src同源结构域(Src homology domain)的蛋白质在细胞内信号传导过程中起到了重要作用,Src同源结构域也常被选为药物受体以及体外药物筛选的模型[49]。

1.3 中药小分子与多肽的相互作用

某些多肽也是药物在体内结合的靶点。例如,淀粉样Aβ肽聚集产生的有毒斑块是引发阿尔茨海默病的原因之一。药物可以通过与Aβ肽结合,阻止其聚集而达到治疗效果[50]。Bazoti等[51-52]利用 ESI-MS研究了Aβ多肽与橄榄苦苷(Oleuroprin)之间的作用,并利用酶解的方法确定了橄榄苦苷的结合位点。细菌细胞壁肽聚糖的多肽侧链是某些抗菌药物的结合位点,药物可以通过结合在肽链末端而阻碍细菌细胞壁的合成,进而达到抑制细菌生长的药理作用[53]。Lim等[53]利用离子喷雾质谱比较了万古霉素(vancomycin)以及利托菌素(ristocetin)与侧链多肽的相对作用力,结果表明前者的结合强度要高于后者。此外,某些多肽也可以作为蛋白质的模型用以研究药物与蛋白质之间的相互作用。Sarni-Manchado等[54]利用 ESI-MS研究了儿茶素及其没食子酰基衍生物与富含脯氨酸的多肽的结合,借此考察了这些成分与明胶蛋白之间的相互作用。

2 基质辅助激光解吸电离质谱在中药小分子与生物大分子相互作用研究中的应用

与ESI相比,MALDI-MS在药物与生物大分子相互作用研究中的应用要少的多[9]。这主要是由于MALDI-MS分析的样品制备过程中常常使用强的酸性基质或有机共溶剂,容易造成非共价复合物的解离,同时,离子化过程容易产生激光诱导的聚合物以及基质加合物,常常干扰复合物的检测。因此,利用MALDI-MS直接检测药物与生物大分子的复合物并非易事。然而, MALDI-MS分析对盐溶液和缓冲液具有一定的耐受能力,在某种意义上可以更好地模拟生理环境。此外,MALDI-MS快速、灵敏,谱图简单且易于自动化,这些优势也促使科研人员致力于利用MALDI-MS研究药物与生物大分子之间的相互作用[9]。

Chen等[55]利用MALDI-MS直接检测了牛血清白蛋白(BSA)与鞣质β-1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-D-葡萄糖(PGG)形成的复合物,发现一个BSA分子上能够结合4个 PGG分子。Aviles课题组的研究人员[56-60]则利用强度衰减MALDI质谱法(Intensity-fading MALDI-MS)研究了配体分子与生物大分子之间的相互作用,其基本原理是通过比较样品中各种配体成分(含阴性对照)在生物靶分子加入前后离子强度的变化,推断配体与生物靶分子相互作用;与阴性对照相比,配体分子在生物靶分子加入之后会选择性地降低。该课题组的研究人员利用强度衰减MALDI-MS研究了3种蛋白酶(包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及牛羧肽酶)与其抑制剂之间的相互作用[56],并从水生动物海葵和水蛭(二者均属于动物类中药)的提取物中筛选出了蛋白酶的抑制剂[56,58-60]。最近,本小组将强度衰减MALDIMS引入了中药小分子与蛋白质相互作用的研究,利用该方法研究了蜂毒肽[61]以及生物碱类成分与钙调蛋白之间的相互作用,并通过滴定法和竞争实验比较了不同药物与靶蛋白的相对结合强度。

Hannewald等[62]利用超滤技术先将药物-微管蛋白复合物与游离的药物进行分离,然后通过MALDI-MS检测复合物变性或酶解后释放的药物分子(如秋水仙碱、长春花碱以及长春新碱),并利用此方法从长春花提取物中筛选出与微管蛋白结合的化学成分。

3 色谱-质谱联用技术在分析中药复杂体系与生物大分子相互作用研究中的应用

与中药单体成分相比,中药提取物(或复方)中的化学成分非常复杂,仅利用质谱技术难以直接研究其中的化学成分与生物大分子之间的相互作用。色谱-质谱联用技术即能够充分发挥色谱高分离的能力,又可以展现质谱高灵敏度和高准确度的检测优势,是分析中药复杂体系中不同化学成分与生物大分子之间相互作用的有力工具。

Su等[63]提出了中药生物指纹图谱分析方法,通过比较中药提取物与生物大分子反应前后其中各种化学组分浓度的变化,推断其与生物大分子的相对结合强度。利用这种分析方法,Su等[64]研究了中药黄连和大黄提取物中的各种成分与小牛胸腺DNA(ctDNA)之间的相互作用,并比较了不同中药成分与DNA分子的相对结合强度。Guo等[65]考察了中药川芎中主要成分与人血清白蛋白(HSA)之间的相互作用,发现p H值的变化能够影响某些中药成分与HSA的结合程度。Li等[66-67]分别研究了忍冬提取物中主要成分与ctDNA和牛血清白蛋白之间的相互作用。Lei等[68]利用该方法从紫杉提取物中筛选出5种与微管蛋白相结合的小分子药物,其中紫杉醇与微管蛋白的作用力最强。

此外,还可以将生物大分子固定在色谱柱的填料上,利用亲和色谱-质谱联用技术研究中药提取物中各组分与生物大分子的相互作用,通过考察各组分的洗脱时间来比较其与生物大分子的结合强度。Su等[69]利用亲和色谱分别从黄连和大黄提取物中筛选出7种和14种与ctDNA结合的成分。Wang等[70]将 HSA固定在色谱柱的填料上,通过二维色谱从龙胆泄肝汤中分离了100余种与 HSA相结合的成分,并通过保留时间、紫外吸收光谱以及质谱数据鉴定了其中的19种化合物。Luo等[71]利用前沿免疫亲和色谱-质谱联用技术从中药叶下珠提取物中筛选并鉴定了HCV NS3蛋白酶的5种多酚类抑制剂。Zhu等[72]则利用该技术从中药鬼箭锦鸡儿提取物中筛选并鉴定了抗表皮生长因子受体的抑制剂。

Van Breemen等[73]提出了脉冲超滤质谱(PUF-MS)分析方法,利用超滤技术先将药物配体与蛋白质的复合物和药物小分子分离,并洗脱掉未结合的药物分子,然后改变洗脱条件,将结合的药物配体从复合物中释放出来,通过比较释放药物配体的浓度来判断其与蛋白质的作用强度。目前,PUF-MS已应用于从化合物库或中药提取物中筛选与靶蛋白质相结合的药物分子[74]。Liu等[75]分别研究了常用于治疗女性更年期综合症的8种植物提取物对雌激素受体α和β的抑制活性,发现红车轴草、牡荆子以及啤酒花的甲醇提取物具有很强的生物活性,通过PUF-MS研究发现染料木黄酮是红车轴草中活性最强的成分。Zhang等[76]利用PUF-MS研究了喜树提取物中化学成分与拓扑异构酶之间的相互作用,发现有3种成分能够与拓扑异构酶结合,其中喜树碱的结合力最强。本小组分别考察了具有抗II型糖尿病活性的4种中药提取物以及1味中药复方对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,并通过PUF-MS技术从这些提取物(或复方)中筛选并鉴定了与α-葡萄糖苷酶相结合的中药成分[77]。以山楂叶总黄酮提取物为例[78],通过酶学检验方法发现其对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性,进一步的筛选发现其中4种黄酮成分能够与α-葡萄糖苷酶相结合,通过串联质谱对这4种成分进行了结构确证,最终确定了山楂叶总黄酮提取物中的α-葡萄糖苷酶的抑制剂分别为槲皮素-3-O-鼠李糖-(1-4)-葡萄糖-鼠李糖苷、牡荆素-2″-O-葡萄糖苷、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和牡荆素。

4 结束语

综上所述,软电离质谱技术已逐渐成为研究中药小分子与生物大分子相互作用的有力工具。利用软电离质谱技术不仅能够定性地研究中药化学成分与生物大分子之间的相互作用,同时还能够获得二者的结合比例、结合强度以及结合位点等方面的信息,为从分子水平上阐明中药单体以及中药复方发挥药效的机理和物质基础提供了科学依据。然而,应该清楚地认识到,目前的研究还仅仅局现于某些中药化学成分以及部分生物靶分子。而中药成分种类繁多,同时,生物体内与疾病相关的生物靶分子也数量众多,要全面了解中药在体内发挥药理作用的过程和基础仍需要开展更多的实验,是一个长期的、系统的、逐步积累的工程。此外,在药物与生物大分子的复合物由溶液进入气相的过程中,相互作用的形式和能量可能会发生改变,如静电作用和氢键作用会被加强,而其他非共价作用(尤其是疏水作用)将会变弱,这为真实地表征溶液中药物与生物大分子的相互作用带来一定的困难。但是,随着相关技术的不断完善和发展,质谱技术必将在中药小分子与生物大分子相互作用的研究中发挥更大作用,为推进中药现代化的进程做出更大的贡献。

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Application of Mass Spectrometry in the Study of Binding Interactions between Small Molecules in Chinese Medicinal Herbs and Biomacromolecules

WANG Zhao-fu1,2,SONG Feng-rui1,LIU Zhi-qiang1,LIU Shu-ying1
(1.Changchun Center of Mass S pectrometry,Changchun Institute of A pplied Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Changchun130022,China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100039,China)

The Chinese medicinal herbs exert their pharmacological effects through a multicomponent and multi-target way.Studies on the binding interactions between the chemical components in the herbal medicine and biomacromolecules can not only provide the scientific basis to clarify the mechanism and foundation underlies the pharmacological effects of the herbal medicines but also provide theoretical guidelines for the design of new drugs.Soft ionization mass spectrometric techniques,especially electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS)and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry(MALDIMS)can transfer the intact complexes formed between drugs and biomacromolecules into the gas phase and detect the existence of the complexes,which have shown promising appli-cation to the study of binding interactions between small molecules in Chinese medicinal herbs and biomacromolecules.The combination of mass spectrometry with chromatographic techniques has also shown great advantages to explore the interactions of the chemical components in complex herb systems towards the biomacromolecules.The paper introduced the application mechanism of mass spectrometry for the analysis of drug-biomacromolecules interactions and summarized the application of soft ionization mass spectrometry in the study of binding interactions between the small molecules in Chinese medicinal herbs and biomacromolecules in recent years.

small molecules in Chinese medicinal herbs;biomacromolecules;soft ionization mass spectrometry;binding interactions

O 657.63

A

1004-2997(2010)03-0129-09

2010-01-10;

2010-04-07

国家自然科学基金(30672600,20873137,20905067,20953001)、国家科技部创新方法工作专项项目(2009IM030400)、吉林省科技发展计划项目(20080736)和长春市科技计划项目(2007GH27)资助

王兆伏(1982～),男(汉族),博士研究生,药物与生物质谱学专业。E-mail:wangzhaofu@sohu.com

刘志强(1962～),男(汉族),研究员,博士生导师,从事天然药物化学与有机质谱学研究。E-mail:liuzq@ciac.jl.cn