宠物犬黑热病的诊断与防控

钟妮娜，彭卫萍，王定检，白益民

(四川农业大学动物医学院，四川 625014)

宠物犬黑热病的诊断与防控

钟妮娜，彭卫萍，王定检，白益民

(四川农业大学动物医学院，四川 625014)

黑热病(Kala-azar)又称内脏利什曼病(Visceral leishmaniasis，VL)，是由杜利什曼原虫(Leishmania donovani)引起，经白蛉(Phlebotomus species)传播所致人兽共患的一种慢性寄生虫性疾病。该病严重危害人类健康，是世界卫生组织的重要目标疾病之一。本文综述了人与宠物犬共患的黑热病的诊断与防控研究进展，为采取更具针对性的预防控制措施提供参考依据。

黑热病;杜利士曼原虫;诊断与防控

内脏利什曼病主要分布在亚洲、非洲、欧洲及拉丁美洲的热带与亚热带地区，据世界卫生组织统计，全球大约88个国家的1200万人口受到该病的感染，约3.5亿人受到感染的威胁。在我国，近年来主要在四川、甘肃、陕西、山西、新疆和内蒙古等地每年都有病例发生，且多集中于川北和陇南。20世纪90年代以来，各地开展大规模以灭犬为主的防治措施后，虽使病例有所减少，但仍不断有病例发生。2010年5月至8月，作者和课题组成员对九寨沟县、黑水县、北川县、茂县、汶川县五个县(农村)的犬只进行黑热病流行病学调查，采集645头份全血样品，其中有宠物犬42头，作荧光定量 PCR诊断，检测结果宠物犬阳性率占6.5%。在白蛉密集活动地如地中海西西里(Sicily)岛的卡塔尼亚(Catania)地区，每年经医院诊断的病例在10～15人之间，在1996和1997年分别报道的38和37例内脏利什曼病中有4例均是家中养有宠物犬的美国驻军或家属。由此看来，与人亲密接触的宠物犬的利什曼原虫病直接影响和威胁着人类的健康和生命。

宠物犬的利什曼病有多种类型，常见的有内脏型和皮肤型两种，不同种或亚种的利什曼原虫感染后所致利什曼病的临床表现各不相同。内脏利什曼原虫病病原体主要有杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)和恰氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)。本病的传播依靠适宜的保虫宿主、媒介和敏感宿主。保虫宿主主要为患者与病犬，皖北和豫东以北平原地区以患者为主，西北高原山区以病犬为主;传播媒介是中华白蛉和罗蛉，传播途径是通过白蛉或罗蛉叮咬传播，偶可经破损皮肤和黏膜、胎盘或输血传播;人群普遍易感，病后有持久免疫力。健康人也可具有不同程度的自然免疫性。

1 临床及病理变化

宠物犬感染利什曼原虫后，病变早期眼观不明显，晚期则常出现体弱、消瘦、精神萎靡、面色苍白、皮肤损害干燥(表现为脱毛、皮脂外溢、结节和溃疡，以头部尤其是耳、鼻、唇部、面部两侧和眼睛周围最为显著，有“癞皮狗”之称)、腹部膨隆(肝、脾肿大所致)、淋巴结肿大、甚至出现恶病质。在印度特别是肤色浅的人，手足、腹部和面部皮肤变灰色，故称黑热病。

白蛉在夜间活动，每年的7～9月最多，当雌性白蛉叮咬病人和受染哺乳动物时，鞭毛型虫体进入机体后在单核－巨噬细胞内脱去鞭毛转变为无鞭毛体，并在白蛉叮咬部位形成由充满无鞭毛体的组织细胞组成的肉芽肿，随后无鞭毛体相继扩散到局部淋巴结和全身各处，刺激肉芽肿细胞介导的免疫反应。在骨髓、淋巴结、皮肤和其他器官可发现感染的单核－巨噬细胞，特别是在脾、肝、骨髓和淋巴结的巨噬细胞中更易发现。虫体增加到一定程度后胀破巨噬细胞，游离后再侵入其他巨噬细胞，如此反复引起巨噬细胞的大量破坏和极度增生，导致脾、肝和淋巴结明显肿大。

2 诊断方法

诊断本病应根据症状、流行病学、病原和血清学检查结果进行综合判定。对于宠物犬诊断若能结合病理学变化将大大提高检测速度。由于黑热病导致宿主各项免疫功能低下进而诱发混合感染，较容易造成误诊，因此寻找有效可靠的诊断方法尤为重要。

2.1 显微镜检法

一般指组织染色镜检、免疫组织化学法及体外培养原虫三种方法。采取皮肤病变的结节内容物(或采取脾脏、骨髓及淋巴结穿刺物)作涂片，用姬姆萨或瑞氏染色观察，检查利什曼原虫的无鞭毛体形态。组织染色镜检准确性较高，查出病原体为诊断依据;用免疫过氧化物酶染色鉴定感染组织中的无鞭毛体形态敏感性较高，但对发病前期犬只的检出率不高;因涂片中无鞭毛体小、数量少，又无明显运动，故用体外培养方法可提高阳性检出率。取病犬脾、骨髓、淋巴结抽取物培养于 Schneider或NNN培养基等，于22℃～26℃培养数天便可见到大量活动的前鞭毛体。

2.2 常规PCR法

一般包括以 ITS即基因组DNA和 kDNA两种基因组为靶基因来进行的PCR以及巢式PCR、PCRELISA等。其中以 ITS为靶基因对于脾脏、淋巴结的原虫检出率有较高的敏感性，但对于血液的检出率较低;以kDNA为靶基因的这种方法对于淋巴结、骨髓和脾脏有较高的检出率，但对于婴儿利什曼原虫的敏感性较低，适合于常规检测;巢式PCR是一种敏感、特异的诊断犬VL的方法，提取白细胞比抽取骨髓和淋巴结穿刺更好在现场推广;PCR－ELISA法特点在于PCR法的定性和ELISA的定量相结合，特别适合于低虫荷的患者、病犬以及局部溃疡刮取标本的检测。

2.3 荧光定量PCR法

相对于其他方法，荧光定量PCR具有较高的敏感性，特别是对宠物犬血液的检测十分敏感，且能定量检测虫体数。

2.4 血清抗体检测

黑热病患者一般利什曼原虫抗体水平高。检测血清抗体的常见方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光试验(IFA)、直接凝集试验(DAT)、免疫印迹试验(IA)、乳胶凝集试验(LAT)。此外还有间接血凝试验(IHA)、对流免疫电泳(CIE)、补体结合试验(CF)。其中IFA的特异性和敏感性都很高，DAT(包括杜氏利什曼原虫凝集抗体)为 97.2%，ELISA为 75%，CIE为 84.3%～97.2%，免疫印迹试验则是一种敏感的、非侵入性、特异的黑热病诊断方法。微量凝集板节约抗原，方法简便快速且经济安全，适宜现场应用。通常宠物诊疗机构常用血凝浓度＞16滴度就能初步诊断为利什曼感染。

2.5 血清循环抗原检测

常用方法有单克隆抗体－抗原斑点试验(McAb－AST)、Dipstick 法、乳胶凝集试验(LA)。McAb－AST方法阳性率可达94%～100%，敏感性、特异性和重复性均较好，简易可行仅需微量血清即可;Dipstick法是将免疫分子亲和原理和免疫印迹法、经典的薄层层析技术想结合，敏感性高、操作简便、报告结果快速;乳胶凝集试验适用于现场调查，操作简便且特异性可达100%。此外还有单克隆抗体－酶联免疫印渍技术(McAb－EITB)和双抗体夹心斑点酶联免疫吸附试验(Sandwish Dot－ELISA)等方法。

3 治疗及预防

3.1 治疗

为避免疾病的蔓延传播，建议扑灭被确诊的黑热病犬只以消除后患，如在一些发达国家和地区一旦确诊便会实施安乐死。但鉴于宠物犬与人类关系密切，朝夕相伴，对宠物犬黑热病的治疗也有一些资料报道。对人类的治疗最常用的药物主要包括五价锑化合物、戊烷脒、两性霉素B、别嘌呤醇等。

五价锑化合物包括葡萄糖酸锑钠和甲基葡萄糖胺锑。通过选择性的抑制利什曼原虫的糖酵解及脂肪酸氧化作用，五价锑化合物有明显的临床疗效，复发较少。但其降解物三价锑毒性较大且近几年不断发现对锑剂耐药或疗效不佳的病例;戊烷脒排泄缓慢易造成中毒，治疗后复发率较高，故只用于对锑制剂治疗无效的患者;两性霉素B选择性地与利什曼原虫的麦角固醇前体相结合从而损伤膜的通透性，导致细胞内物质外渗，因此小剂量的两性霉素B对其有选择性毒性作用;别嘌呤醇与五价锑有协同作用，对利什曼原虫有明显毒性;反乌头酸为其酶的抑制剂，能抑制原虫的能量代谢，在体外与其他抗原虫药联用，能显著抑制细胞内原虫的转化与增值;甘草查尔酮A属甘草黄酮类化合物，具有多种生物活性，能完全抑制利什曼原虫前鞭毛体增值，有强大的细胞内杀原虫作用。无鞭毛体对其更加敏感，且药物浓度大小对宿主细胞的毒性作用都不明显。

3.2 预防

免疫预防集中在应用重组利什曼原虫抗原和合适的佐剂研制疫苗，诱导保护性免疫反应，因此免疫佐剂的选择十分重要。以超声波破碎巴西利什曼原虫前鞭毛体制备的可诱性抗原搭配佐剂在临床上已得到验证，对利什曼病具有良好的预防作用。

全虫疫苗是以活的或死的利什曼原虫前鞭毛体作为免疫接种抗原，诱导机体产生针对利什曼原虫的免疫力，包括活疫苗及减毒活疫苗。直接以活前鞭毛体感染人体后，容易造成机体免疫力低下及经久不愈的皮肤损害，因而转向减毒活疫苗及灭活疫苗的研究，一般是通过射线照射、基因灭活或置换等方法。减毒后的利什曼原虫虽没有完整的复制周期，但仍能长时间地在机体内存活，诱导保护性免疫力的产生;灭活疫苗是由人工大量培养的前鞭毛体经理化方法灭活后制成的一类疫苗;重组抗原疫苗是指利用基因重组技术，将经筛选的、能有效诱导保护性免疫力产生的病原体抗原的编码基因引入细菌、病毒的基因组内，通过细菌、病毒的繁殖而获取大量相应的抗原，所获抗原经分离、提纯后用于免疫接种。它包括了从克隆利什曼原虫基因获得的免疫蛋白和从转化表达载体提纯的免疫蛋白;非蛋白抗原疫苗是指利什曼原虫前鞭毛体表膜上的多糖与膜上的脂类结合成大分子的糖脂进而诱发保护性免疫力;重组活载体疫苗是将编码病原体有效免疫原的基因插入载体(减毒的病毒或细菌疫苗株)基因组中，接种后，随疫苗株在体内的增殖，大量所需的抗原得以表达，从而诱导机体产生针对相应病原体的免疫保护力;DNA疫苗是用编码病原体有效免疫原的基因与真核表达质粒构建的重组体直接免疫机体，通过宿主细胞摄取并表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫的疫苗。其诱导产生的保护性免疫应答可以达到预防和治疗的目的。

3.3 生物防控

鉴于白蛉是黑热病重要的传播媒介，控制白蛉便是消灭黑热病的根本措施。在白蛉觅食期间，可在白蛉活动的有限范围内，如人群居住环境和居室内滞留喷洒杀虫剂，并在身体裸露部位涂驱避剂。使用2.5%溴氰菊脂浸泡过的蚊帐或安装纱门、纱窗对家栖和近家栖白蛉预防效果明显;而犬作为黑热病的重要保虫宿主，对黑热病的传播作用不可忽视，故在犬源型黑热病流行区应以查治和捕杀病犬，消灭传染源为主。

黑热病的治疗和预防面临挑战，在人们从事生产建设过程中，人与动物之间密切接触(尤其在犬成为宠物或伴侣后)、人的饮食习惯和宗教习俗、环境污染、地质灾害(如2008年地震灾害)等都有可能引起人兽互传。同时，随着改革开放，国外带病犬进入国内市场，应加强检疫，防止国外人兽共患病进入我国。

现代社会节奏的加快使得宠物对人类的生活影响加大，成为人类生活的忠实伴侣。对宠物人类不可过于亲近，要保持适宜的距离避免人兽共患病的感染并且定期到医院进行体检，做到早发现早治疗。兽医工作者不但要做好本职工作，认识到疾病预防保护是兽医工作的重要组成部分，还要做好宣传;不仅要了解利什曼病的新动态，还要使宠物爱好者了解如何饲养合格的犬。同时，政府也应该加大宣传力度并政策化黑热病的预防工作，组织兽医工作者接受正规的专业培训提升他们的业务能力。近年来虽然各个地方都采取了一些有效的措施来控制宠物犬免受寄生虫和传染病的侵害，但彻底地防控宠物疾病的任务仍然任重道远。

［1］Harms C.Schönian G，Feldmeier H.Leishmaniasis in Germany［J］.Emerg Infect Disease，2003，9(7):872－875;

［2］Miro G，Cardoso L，Pennisi MG，et al.Canine leishmaniosis–new concepts and insights on an expanding zoonosis:part two［J］.Cell，2008，24(8):372－376;

［3］高斌，李国茹，郁涛，等.1995～1999年四川省黑热病病例分析［J］.中国寄生虫病防治杂志，2001，2(1):42.

［4］唐泽民，李国茹，王顺高，等.北川县黑热病流行情况调查与控制［J］.防医学情报杂志，2006，6:71－72.

［5］Barrouin－Melo SM，Larangeira DF，de Andrade Filho FA，et al.Can spleen aspirations be safely used for the parasitological diagnosis of canine visceral leishmaniosis? A study on asymptomatic and polysymptomatic animals［J］.Vet J.2006，171，331－339

［6］Giunchetti，RC， Martins－FilhoOA， CarneiroaCM， et al.Histopathology，parasite density and cellphenotypes ofthe popliteal lymph node in canine visceral leishmaniasis［J］.Vet Immunol Immunopathol 2008，121:23－33.

［7］Saridomichelakis MN，Mylonakis ME，Leontides LS，et al.Evaluation of lymph node and bone marrow cytology in the diagnosis of canine leishmaniasis(Leishmania infantum)in symptomatic and asymptomatic dogs［J］.Am J Trop Med Hyg.2005，73:82－86.

［8］段明，李黎，李彦.黑热病65例流行病学分析［J］.预防医学情报杂志，2006，22(1):83－84.

［9］桂爱芳，左胜利，吴锦华，等.湖北省黑热病流行态势的评估［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000，6(3):170－172.

［10］Lachaud，L.Marchergui－Hammami S， Chabbert E， et al.Comparison of six PCR methods using peripheral blood for detection of canine visceral leishmaniasis［J］.J Clin Microbiol，2002，40:210－215.

［11］Manna L，Realeb S，Vitale F，et al.Real－time PCR assay in Leishmania－infected dogs treated with meglumine antimoniate and allopurinol［J］.Vet J，2008，177:279－282.

［12］刘桂清，郝建平，孙立彬.宠物犬利什曼病的诊断和治疗［J］.上海畜牧兽医通讯，2007，(2):90.

［13］王稣武，龚大春.从城市养犬看宠物防病存在的问题［J］.当代畜牧，2001，(4):32－33.

［14］Beverley SM，Ismach RB，Pratt DM.Evolution of the Genus Leishmania as revealed by comparisons of nuclear DNA restriction fragment patterns.Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84(2):484－488.

［15］郑学礼，胡孝素，陈建平.我国不同流行区内脏利什曼原虫分离株kDNA的PCR－SSCP分析［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17(6):346－349.

［16］王勇，分子方法在利什曼原虫虫株鉴定和系统发生研究中的应用［J］.国际医学寄生虫病杂志，2006，9(5):239－242.

［17］王兆俊，熊光华，管立人.新中国黑热病流行病学和防治成就［J］.中华流行病学杂志，2000，21(1):51－54.

［18］刘桂清，郝建平，孙立彬.宠物犬利什曼病的诊断和治疗［J］.上海畜牧兽医通讯，2007，2:90.

［19］Ferreira Ede，C.de Lanaa M，Carneiro M，et al.Comparison of serological assays for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in animals presenting different clinical manifestations［J］.Vet Parasitol.2007，146:235－241.

［20］Mettler M.Grimm F，Capelli G，et al.Evaluation of enzymelinked immunosorbent assays，an immunofluorescence－antibody test，and two rapid tests(immunochromatographic－dipstick and geltests)for serological diagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infection in dogs［J］.J Clin Microbiol，2005，43:5515－5519.

［21］Dereure J， El－Safi SH， Brucheton B， et al. Visceral Lesishmaniasis in eastern Sudan: parasite identification in humans and dogs; host－parasite relationship［J］. Microbes Infection. 2003，5:1103－1108.

［22］Markell EK，John DT，Kroteski WT.Medical Parasitology［M］.Eighth Edition.W.B.Saunders Company，Printed in USA.1999.P154－160.

［22］Bogitsh BJ，Cheng TC.Human Parasitology.Second Edition.Academic Press［M］，Printed in the USA.1998，101－107.

［23］薛纯良，许隆祺，主编.寄生虫病诊断与治疗［M］.湖南长沙:湖南科学技术出版社.2002:31－32.

［24］Dujardin JC.Risk factors in the spread of leishmaniases:towards integrated monitoring?Trends Parasitol.2006，22:4－6.

［25］Pennisi MG，De Majo M，Masucci M，et al.Efficacy of the treatment of dogs with leishmaniosis with a combination of metronidazole and spiramycin［J］.Vet.Rec.2005，156:346－349.

［26］马莹，胡孝素， KP Chang.Dipstick法诊断黑热病患者28例［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000，18(4):252.

［27］刘维达，廉翠红.深部真菌感染的早期诊断［J］.中华检验医学杂志，2003，26:583.

［28］税国顺，毛翠，何代莉.黑热病并发败血症1例报告［J］.中国煤炭工业医学杂志，2000，3:769－770.

［29］芦殿梅，蒋次鹏.黑热病诊断方法国内研究综述［J］.实用寄生虫病杂志，1995，3(20):79－81.

［30］Zhang FN，Li GR，Lei Y，et al.Analysis on leishmanissis in Sichuan Province from 1984 to 2005［J］.J Path Bio1.2007，2(1):79～80.

［31］张富南，李国茹，雷杨，等.四川省1984－2005年黑热病发病情况分析［J］.中国病原生物学杂志.2007，2(1):79－80.

［32］Dantas－Torres F. Leishmune1 vaccine: the newest tool for prevention and control of canine visceral leishmaniosis and its potential as a transmission－blocking vaccine［J］. Vet. Parasitol.2006，141:1－8.

Diagnosis and Control of Kala Azar in the Pet Dogs

ZHONG Ni－na，PENG Wei－ping，WANG Ding－jian，BAI Yi－min
(Animal Medical College，Sichuan Agricultural University，Sichuan 625014，China)

Kala－azar，also named as visceral leishmaniasis(VL)，is an important chronic zoonotic parasitic disease that is potentially fatal to humans and dogs.It is caused by Leishmania donovani and its transmission vector is sandfly.Leishmaniasis is one of World Health Organization’s profitable target diseases for its bad effect on humans.This article summarizes and makes a prospect of diagnosis and prevention of leishmanasis，and gives suggestions on adopting more effective measures to control this parasitic disease.

Kala－azar;Leishmania donovani;Diagnosis;Prevention

R33;R184

A

1671－7856(2010)11、12－0156－04

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.11、12.038

2010－08－20

钟妮娜，教授，E－mail:Zhongnina45@yahoo.com.cn。