鸡生化基因位点检测方法的建立及在SPF鸡群中的应用

韩凌霞，高鹏飞，2，刘霄磊，司昌德，曲连东

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，哈尔滨 15001; 2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

研究报告

鸡生化基因位点检测方法的建立及在SPF鸡群中的应用

韩凌霞1，高鹏飞1，2，刘霄磊1，司昌德1，曲连东1

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，哈尔滨 15001; 2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

目的建立鸡生化标记检测方法，用于SPF鸡群的遗传学检测。方法参照国家标准《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法》，应用乙酸纤维素板，建立SPF鸡生化标记位点的检测方法。结果共有7种同工酶可以用于鸡的生化检测，其中血红蛋白－β链(Hbb)的检测组织为溶血素，转铁蛋白酶(Trf)的检测组织为肺脏，碳酸酐酶－2(Car2)的检测组织为肝脏或溶血素，异柠檬酸脱氢酶－1(Idh1)、苹果酸酶－1(Mod1)、碱性磷酸酶－1 (Akp1)检测组织为肾脏，酯酶－1(Es1)检测组织为血清。结论建立了鸡生化标记检测方法，并对BWEL－SPF鸡群和Line－22鸡群进行了分析，发现都存在多态性。

SPF鸡;生化标记位点;乙酸纤维板电泳法

无特定病原体(specific pathogen－free，SPF)鸡是指排除了特定病原体的一类鸡，属于实验动物范畴，SPF鸡及鸡胚是动物病毒学、禽病学、生命科学等研究的重要实验材料，也是禽流感疫苗、伪狂犬病疫苗、麻疹疫苗等生物制品生产的主要原材料，其遗传学背景直接关系到病毒的复制能力、疫苗的产量以及对禽病的敏感性等，是必须考虑的一个重要生物学参数。

生化基因位点的编码产物同工酶是生物体内代谢过程中非常重要的调节酶类，具有多态性和共显性，能直接反映蛋白质水平的差异，在遗传育种、种群结构分析、分类及进化等研究中具有独特的意义。本研究利用乙酸纤维素板，参照《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法》［1］GB/T 14927.1－2001，摸索了针对鸡的同工酶检测方法，并对本单位保存的BWEL鸡群和Line－22鸡群等品系进行了检测。

1 材料和方法

1.1 实验动物

BWEL－SPF鸡群是我国唯一自主培育净化的一个SPF鸡品系，已封闭饲养15个世代。Line－22鸡是另一个封闭群，已繁育3个世代。1日龄雌性BWEL－SPF鸡5羽，1日龄Line－22鸡群K2家系雌性5羽，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心【SCXK(黑)2006－2009】提供。

1.2 仪器设备与试剂

DYY－6C型稳压稳流电泳仪、电泳微量点样器和醋酸纤维板购于北京六一仪器厂，实验动物小鼠遗传检测试剂盒购自中国药品生物制品检定所(批号:0407)，检测所用生化试剂均为分析纯。

1.3 组织样品的制备

将雏鸡心脏采血，分别制备含5%柠檬酸钠的抗凝血和不含抗凝剂的全血。将抗凝血离心，5000 r/m in，离心5 m in，弃上清。在细胞压积内加入4倍体积的蒸馏水，剧烈震荡1 min，制备溶血素。另取部分肝脏、肺脏和肾脏，分别在研钵中加石英砂研磨，在1.5 m L的EP管中称重，加2倍(体积/重量)蒸馏水匀浆，4℃12 000 r/m in，离心10 m in。上清在－20℃备存。

1.4 同工酶在不同组织中表达情况的检测

参照国家标准《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法》［1］制定的电泳和显色方法，分别对所有被检组织中的碱性磷酸酶－1(Akp1)、酯酶－1 (Es1)、异柠檬酸脱氢酶－1(Idh1)、苹果酸酶－1 (Mod1)、转铁蛋白(Trf)、碳酸酐酶－2(Car2)和血红蛋白－β链(Hbb)等7种同工酶的表达情况进行了检测。

2 结果

2.1 Akp1表达情况的检测

显色结果显示，在肺、肝、肾和血液组织中，均能出现一条带(图略)，但肾组织中的条带较清晰，被检BWEL鸡之间和Line－22鸡之间，电泳速率存在差异，如图1所示(彩插12)。

2.2 Es1表达情况的检测

显色结果表明，Es1在血清中出现一条带，相对于Line－22－K2带型一致，BWEL－SPF鸡群个体之间的泳动速度有差异，如图2所示(彩插12)。

2.3 Idh1和M od1表达情况的检测

Idh1和Mod1采用相同的显色条件，结果表明，肾脏中出现较清晰的2条带，BWEL鸡群个体间带型一致，而Line－22－K2的第5个个体(泳道10)表现为慢带，如图3所示(彩插12)。

2.4 Tr f表达情况的检测

Trf属于血清蛋白酶，但在肺、肝、肾、脾、心脏和溶血素等各组织中都有深浅、大小不同的条带(图略)，但带型不同:血清中存在多态现象，多数为3条带，少量存在4条带;在溶血素中只出现2条带，且与血清中的2条快带位置一致;而在肺脏中均只表达1条带，在BWEL－SPF鸡中出现个体差异，Line－22－K2表现一致。如图4所示(彩插12)。

2.5 Car2表达情况的检测

Car2为红细胞酶，通常采用溶血素进行检测。显色结果发现，在鸡的多种组织中都出现了条带，而且含量较多，但带型不同。在肝脏中多达5条以上，存在不少于4条带，但肉眼观察条带接近，带型相似。在溶血素中可以清晰判断的有2条带，且品系间无明显差异。如图5所示(彩插12)。

2.6 Hbb表达情况的检测

染色结果表明，在溶血素组织中可以明显看到1条带，品系间无差异，如图6所示(彩插12)。

3 讨论

目前国内外对鸡的生化标记位点的检测多利用血浆蛋白酶进行检测，如利用Akp、Trf、Es1、血清酯酶［2－9］等，用于品种遗传学背景的比较［10］，或者进行多态性的分析。但是上述研究都只利用血液组织进行了分析，使适用的同工酶位点有限，造成了获得生物学信息的局限。

本研究中我们首先利用Akp1、Car2、Trf、Es1、Idh1、Mod1、Hbb、Gpd1和Es3等9个生化标记位点对鸡不同组织中的表达情况进行了摸索，结果发现Gpd1和Es3在各组织中都不能形成清晰的带型，而只有Hbb、Trf、Car2、Idh1、Es1、Mod1和Akp1等7种同工酶出现稳定的带型，具有较好的重复性，所以最终选定该7个位点，建立同工酶检测方法。在进行组织匀浆时，首先选择了超声破碎的方法，效果比较好，使组织中的同工酶较彻底的释放出来，但破碎过程中产热容易使酶失活，所以最终选择研磨加遇冷蒸馏水的方式制备组织匀浆。

Akp1虽然在各种被检组织上均出现条带，而且在血清样品中条带较清晰，但在肾组织中的含量最高，因此选择肾脏检测Akp1位点;Idh1和Mod1在肾脏样品中含量很高，经过超声破碎的样品有明显的两条带;Es3位点显色结果不清晰，没有明显的带型，不能作为检测项目;Trf为血清蛋白，虽然从肺、血清和溶血素样品中都能分辨出条带，但在血清中带型最清晰，因此选择血清作为检测Trf的组织来源。

根据建立的生化基因位点检测方法，对BWELSPF鸡群和Line－22鸡群K2家系进行了多态性的初步检测，结果发现BWEL－SPF鸡群在Trf、Es1和Akp1存在带型差异，Line－22鸡群在Idh1、Mod1和Akp1存在差异，表明2个鸡群的遗传学背景都存在一定程度的多态性，这也符合封闭群实验动物的遗传特点要求。

虽然本研究建立的生化标记位点检测方法对SPF鸡群的遗传结构分析提供了一定依据，但由于该方法在敏感性和特异性上的不足，还难以对实验禽类进行更精确的多态性分析。有关分子水平的遗传学检测方法的建立，将在后续研究中进行报道。

(本文图1～6见彩插12。)

［1］中华人民共和国国家标准哺乳类试验动物的遗传质量控制［GB］.国家质量监督检验检疫总局.2001.8.29.

［2］Hashiguchi T，Tsuneyoshi M，Nishida T，et al.Phylogenetic relationships determined by the blood protein types of fow ls［J］.J Zootech Sci，1981，52(10):713－729.

［3］郑晓锋，刘文超.滨白鸡三种血清酶同工酶遗传特性及其育种应用价值的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，1995，9:12－15.

［4］马力，刘晓刚.罗曼蛋鸡血清蛋白多态性的研究［J］.西南民族学院学报(自然科学版)，1998，24(1):51－53.

［5］张永亮，简承松，朱文适，等.贵州乌蒙乌鸡血浆同工酶的遗传多态性［J］.西南农业学报，2000，13(1):87－92.

［6］张永亮，简承松，朱文适，等.贵州小香乌鸡血浆同工酶的遗传多态性［J］.山地农业生物学报，2000，19(1):16－20.

［7］王民，张才骏.蓝马鸡和藏马鸡的血清酯酶同工酶酶谱［J］.畜牧与兽医，2002，23(12):3－4.

［8］耿照玉，姜润深.淮南麻黄鸡血清酯酶多态性与屠宰性能及肉质的关系［J］.中国兽医学报，2003，23(1):82－83.

［9］王延峰，齐龙，文风云，等.陕北鸡血清酯酶多态现象的初步研究［J］.延安大学学报(自然科学版)，2005，24(1):80－82.

［10］刘博，谢芳，陈国宏，等.我国部分地方鸡种血浆蛋白质(酶)多态性分析［J］.扬州大学学报，2004，25(1):10－15.

Estab lishm ent of a M onitoring M ethod of Biochem ical M arkers in BW EL-SPF Chicken Popu lations

HAN Ling－xia1，GAO Peng－fei1，2，LIU Xiao－lei1，SI Chang－de1，QU Lian－dong1
(1.Laboratory Animal Center of Harbin Veterinary Research Institute，CAAS，Harbin 150001，China;
2.College of Animal Science and Technology，Shanxi Agriculture University，Taigu 030801)

ObjectiveTo establish a detection method of biochemical markers for genetic monitoring of SPF chickens.M ethod According to national standard“Laboratory Animal－Genetic Monitoring:Methods for Biochemical Markers of Inbred Mice and Rats”，cellulose acetate membrane electrophoresis was used to develop the monitoring method..ResultsIt was showed that 7 types of isozymes could be used to monitor the chicken populations，hemoglobin β－chain (Hbb)should be tested in the hemolysin，transferrin(Trf)in the lung，carbonic anhydrase－2(Car2)in the liver or hemolysin，isocitrate dehydorgenase－1(Idh1)，malic enzyme－1(Mod1)and alkaline phosohatase(Akp1)in the kidney，and esterase－1(Es1)in the serum.Conlusions A genetically detection method of biochem ical markers for chickens has been established，and polymorphisms are identified in the BWEL－SPF chicken and Line－22－k2 chicken populations.

SPF chicken;Biochemical marker;Polymorphism;Cellulose acetate membrane electrophoresis

R－394

A

1005－4847(2010)02－0161－03

2009－07－13

黑龙江省科技攻关项目(PC06S17);黑龙江省自然科学基金项目(C2007－06)。

韩凌霞(1971－)，女，博士，从事实验动物学研究。Email:hlx1993@126.com