硫氧还蛋白系统调控细胞周期的研究进展

刘晓慧 刘 华王晟东 白 洁 (昆明理工大学生命科学与技术学院,云南 昆明 650224)

硫氧还蛋白系统调控细胞周期的研究进展

刘晓慧 刘 华1王晟东 白 洁 (昆明理工大学生命科学与技术学院,云南 昆明 650224)

硫氧还蛋白;硫氧还蛋白还原酶;硫氧还蛋白结合蛋白 2;细胞周期

硫氧还蛋白系统除了调节机体内氧化还原反应,还具有多种生物学活性。在癌症组织细胞中硫氧还蛋白表达增高,提示硫氧还蛋白系统与肿瘤有关。最近研究表明硫氧还蛋白系统在细胞周期中起到重要调节作用,本文论述了硫氧还蛋白系统调控细胞周期的研究进展。

1 硫氧还蛋白系统

硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白 (Trx),硫氧还蛋白还原酶 (TrxR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 (NADPH)。Trx通过其活性中心与底物蛋白相互作用,还原底物的二硫键为巯基,同时 Trx被氧化,而氧化状态的 Trx可以在 TrxR和 NADPH的作用下被还原,从而构成硫氧还蛋白氧化还原的循环系统。目前,已经发现多个硫氧还蛋白家族的成员。其中,哺乳动物Trx1和 TrxR1主要定位于细胞质,而 Trx2和 TrxR2则定位于线粒体。硫氧还蛋白系统在生物体内起着不可缺少的作用,敲除这 4个基因中任何一个,就会导致小鼠胚胎死亡〔1～3〕。由此可见,硫氧还蛋白系统在生物体中的重要性。

Trx又称成人 T细胞白血病衍化因子、早孕因子等。为12 kD的小分子量蛋白,普遍存在于各种细胞中,拥有保守的氧化还原活性位点序列:Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys。它具有抗氧化和活性氧自由基的清除作用,使细胞免受氧化应激。Trx是核苷酸还原酶的氢供体,它是 DNA合成所必需的。同时,Trx具有调节转录因子NF-κB,AP-1的活性,Trx通过抑制凋亡信号调节激酶 1(ASK-1)抑制凋亡,因此,它还与细胞增殖和凋亡有着密切关系。此外,Trx在神经生长因子诱导神经突触生长起重要作用并保护神经元免于神经退行性改变〔4〕。

硫氧还蛋白还原酶是一种 NADPH依赖的,含硒的黄素蛋白,有三种,分别为 TrxR1,TrxR2,TGR(主要存在于睾丸),具有二硫化物还原酶活性。其N端有一段保守的氧化还原催化活性位点:Cys-Val-Asn-Val-Gly-Cys;C端则含有 Gly-Cys-SeCys-Gly(SeCys是硒半胱氨酸)序列,存在于这三种酶 C端的活性位点距离谷胱甘肽样脚手架结构约 16个残基长度〔5～8〕。N和 C端两个位点对 Trx还原酶的氧化还原活性极其重要〔9〕。

硫氧还蛋白结合蛋白 2(TBP-2),又称为硫氧还蛋白相互作用蛋白 (TXN IP)和维他命 D3上调蛋白 1(VDUP1),Nishiyama等〔10,11〕从酵母双杂交系统中分离出 TBP-2。TBP-2能结合还原态的 Trx〔12〕,它与 Trx的催化活性中心作用,从而抑制 Trx的还原活性,因此,TBP-2被认为是 Trx一个内源性的抑制物。

2 细胞周期

细胞周期是一种非常复杂和精细的过程,有多种蛋白调节这个过程。此过程的核心是周期蛋白依赖蛋白激酶 (cdks)和周期蛋白 (Cyclins)的相互作用。Cdks是一类依赖 Cyclin的蛋白激酶,在细胞周期调控中处于中心地位。Cdks在整个细胞周期中的含量是恒定的,单独存在的 cdk无活性,在不同的细胞周期时相中,与相应的 Cyclin结合后构象发生变化,通过被磷酸化和去磷酸化表现为活性和无活性状态。有活性的 Cyclincdk复合物呈现出蛋白激酶活性,使不同的底物蛋白磷酸化,从而启动或调控细胞周期的主要事件,驱动细胞周期的进程。

Cyclin是 20世纪 80年代研究卵母细胞首先发现的,之后在其他一些物种中也发现和证实了 Cyclin的存在,现在已发现的哺乳动物 Cyclin有 14大类,它们可分为 G1期 Cyclin和M期Cyclin。Cyclin的表达具有典型的周期性和时相特异性,Cyclin D1在细胞的增殖过程中起着重要作用,是 G1期细胞增殖信号〔13〕,它还调节视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb)的磷酸化状态〔14〕,很多肿瘤的发生与 CyclinD1的过表达有关〔15～17〕。除 Cyclin外,细胞内还存在一些对 cdk起负调控作用的分子,如 p21,p27等,p21可抑制 CyclinD1-cdk4/6和 CyclinE-cdk4等多种 Cyclincdk复合物的活性,从而使细胞周期停滞在 G1期,抑制细胞增殖〔18〕。

3 硫氧还蛋白系统调控细胞周期

3.1 硫氧还蛋白系统调控细胞 G1/S期 硫氧还蛋白已成为癌症治疗的一个重要的靶点〔19〕,这不仅与其抗凋亡作用有关,而且硫氧还蛋白与细胞的增殖也有密切的关系。Trx能调控细胞周期的 G1,S以及 G2/M期〔20〕,其中尤其以对 G1/S调控作用的研究报道居多。硫氧还蛋白调节细胞周期可以通过 Trx的氧化还原性,调节与细胞周期进程相关的蛋白活性。如当刺激的细胞进入 G1期时,Trx通过还原核氧化还原因子 (Ref-1/Hap-1)来调控 AP-1(Fos/Jun异二聚体 )活性〔21〕,而 Ref-1/Hap-1和AP-1都具有调节细胞周期的作用。Muller发现在酿酒酵母 (Saccharomyces Cerevisiae)中,Trx1和 Trx2基因的双缺失突变,细胞周期改变明显,S期延长了 3倍,而 G1期几乎缺失,并且增殖的时间增加了 33%,这可能是由于在 S期 DNA合成,核糖核酸还原酶依赖于 Trx系统的活性,因此,Trx降低则可能导致DNA复制的减慢,从而抑制了细胞增殖进程。有趣的是,而 Trx1或 Trx2基因单缺失突变,不会影响到酵母细胞的生长速度 ,形态以及周期〔22〕。Muller〔23〕还报道了 ,当谷胱甘肽还原酶缺失时,氧化的谷胱甘肽增加,在这种情况下需要 Trx,细胞才能维持正常的生长。陈孝平等用多种方法,如用维生素 C,转染 pcDNA-Trx以及直接将 Trx1蛋白加入到培养液中等刺激乳腺癌MCF-7细胞,结果无论是胞内还是胞外,Trx1水平的上升均会促使MCF-7细胞进入 S期〔24〕。以上研究提示,Trx可能是通过其氧化还原活性,调节细胞周期的进程。

然而,Trx对细胞周期的调节作用并不一致,Trx也有抑制细胞周期的作用,Hwang等〔25〕报道,Jun激活域结合蛋白 1(Jab1)介导的增殖信号机制是通过增加 AP-1转录的活化以及p27Kip1的降解来调节细胞周期和生长。Trx与 Jab-1结合,从而抑制了 Jab1依赖的 Jab-1诱导 p27Kip1的降解,这是由于 Trx与 Jab-1竞争性的结合 p27Kip1,保护了 p27Kip1被 Jab1降解,从而导致细胞周期 G0/G1期的阻滞。在 Trx过表达的 HT1080细胞中,细胞分布在 G0/G1期,S期以及 G2/M期与野生型明显不同,其 G1期细胞增加至 82.2%,而 S期细胞则显著降低至6%,这意味着某些细胞中 Trx高表达时细胞的增殖受到了显著的抑制。

BBSKE〔1,2-二 (1,2-苯并异硒唑 -3(2H)-酮 )〕乙烷 ,简称BBSKE)是北京大学药学院设计合成的一类新型含硒化合物,它是硫氧还蛋白还原酶 (TrxR)的抑制剂。Shi等〔26〕用这种药物刺激前列腺癌 PC-3和DU145细胞,48 h后,发现这两种细胞都阻滞在 S期,BBSKE就扰乱了细胞通过 S期的进程,分析细胞周期的调节蛋白,发现BBSKE增加了 CyclinA,CyclinE和 p21的表达,而降低了 CyclinB1,CyclinD1和 cdk4的表达,抑制了这两种细胞的繁殖。Zhao等〔27〕证明 BBSKE能抑制五种人癌细胞系A549,HeLa,Bel-7402,BGC823和 KB的生长和增殖。Peng等〔28〕研究了 BBSKE对人白血病细胞系 HL-60和 K562的作用,发现它能剂量和时间依赖性地抑制这两种细胞的生长。由此可见硫氧还蛋白还原酶在细胞生长繁殖中起重要作用。

芽殖酵母基因的上游区域发现有 Mlul细胞周期盒(MCB),它编码复制酶和一些在细胞 G1/S期很重要的蛋白〔29〕。TrxR本身包含了MCB,并且在 G1/S期表达量最高。细胞内的氧化还原状态改变时,如暴露于 H2O2,氧化状态的 Trx增多,从而诱导 TrxR以及上游MCB基因的表达;而当暴露于羟基脲,Trx保持其还原状态,则能抑制MCB基因的表达。这表明 Trx的氧化可以激活MCB,也说明 Trx氧化还原状态与调节细胞周期的特异性基因转录有关。

TBP-2具有调控细胞周期的进程作用。在许多肿瘤中,TBP-2是低表达的,而增加 TBP-2的表达可以抑制细胞周期的进程,从而抑制肿瘤细胞的增殖。Jeon等〔30〕发现与野生型小鼠成纤维细胞相比,TBP-2-/-小鼠成纤维细胞增殖更快,同时p27Kip1的表达降低,p27Kip1是 cdk的抑制物,TBP-2能抑制Jab-1对 p27Kip1的降解,因此,TBP-2表达增高稳定了 p27Kip活性。Nishinaka等 报道了,在 TBP-2过表达的 HTLV-Ⅰ阳性 T细胞中,可以观察到 G1期的阻滞,同时发现 p16表达的增加,视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb)磷酸化减少。p16结合并抑制cdk4,cdk6,从而使 Rb去磷酸化,来抑制 HTLV-Ⅰ阳性 T细胞由 G1期进入 S期,抑制了细胞的增殖。Han等〔32〕用 TBP-2的表达质粒转染 293和 N IH3T3细胞,TBP-2的过表达通过抑制Cyclin A启动子活性,能使细胞阻滞在 G0/G1期。Cyclin A是细胞有丝分裂过程一个关键蛋白,它的水平在 G1/S期开始增加,一直持续到 G2/M期。早幼粒细胞白血病锌指亦能抑制Cyclin A活性,TBP-2可以增强早幼粒细胞白血病锌指的活性。因此,TBP-2过表达是可以抑制细胞的增殖。总之,TBP-2可通过细胞周期的调节而抑制细胞的增殖。

因此,硫氧还蛋白系统既能促进细胞的增殖,也能抑制细胞的增殖,这可能有细胞的特异性有关。

3.2 硫氧还蛋白系统调控细胞 G2/M期 硫氧还蛋白对细胞G2/M期进行调控的研究报道较少。对称的二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide,DADS)是一种大蒜提取物,用它处理结肠癌HCT-15细胞,造成短暂的 G2/M期阻滞,同时抑制 p34cdc2的活性,p34cdc2是细胞周期调节的重要的蛋白,与M期有关。当小鼠胚胎阻滞在双细胞阶段,外源性超氧化物歧化酶 (SOD)或Trx可能通过还原活性使 p34cdc2去磷酸化,恢复 p34cdc2的活性,从而使细胞周期进入有丝分裂。这些表明,Trx可能通过还原活性调节细胞内的有些细胞周期的调节因子活性,来影响细胞周期的进程。

用α-二氟甲基鸟氨酸 (DFMO)处理 HT29细胞,DFMO是多胺生物合成的特异性抑制剂,细胞中多胺的耗减,可造成 Trx的下调和 G2/M期阻滞。研究表明,Trx的下调和 G2/M期阻滞之间有关系,用反义 Trx转染细胞后,γ射线辐射经 DFMO处理的细胞,发现细胞 G2/M期的阻滞出现显著的延迟,并且细胞死亡也减少了。细胞死亡减轻是由于延迟了细胞周期阻滞,细胞具有较长时间修复 DNA〔33〕。而在 HT1080细胞中,Trx过表达可以出现 G2期检验点的缺失,并且诱导细胞对γ射线辐射的敏感化〔34〕。因此,Trx的表达不同时对细胞 G2/M期具有不同的调节作用。

4 结 语

综上所述,硫氧还蛋白系统确实在调节细胞周期的进程中起重要作用,它可能是通过调节细胞内的氧化还原状态,改变细胞周期的相关调控蛋白活性或者直接调节细胞周期相关蛋白的表达。然而,有关硫氧还蛋白系统调控细胞周期的研究报道较少,硫氧还蛋白系统如何调节细胞周期的分子机制还不十分清楚。因此,进一步研究硫氧还蛋白系统在调节细胞周期中的作用,将为癌症和老化等疾病的发病机制及防治提供重要的理论依据。

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〔2009-04-27收稿 2009-08-26修回〕

(编辑 李相军 /张 慧)

Q253

A

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云南省中青年学术技术带头人后备人才基金资助项目(2006YP01-07);昆明理工大学科研启动经费资助项目;云南省自然科学基金(2007C177M)

1 云南省第一人民医院

白 洁 (1966-),女,博士,教授,博士生导师,主要从事硫氧还蛋白生物活性和神经退行性疾病的研究。

刘晓慧 (1984-),男,在读硕士,主要从事肿瘤分子机制研究。