中医证候与基因、蛋白质、代谢组学研究思路探讨

朱明丹,杜武勋,姜 民,刘长玉,宋启刚,魏 营

(1.天津中医药大学第二附属医院,天津 300193;2.天津南开大学药学院,天津 300071)

证候实质的研究一直是中医学术界研究的热点。几十年来国家投入大量的人力和财力,但其研究并未取得突破性的成果,甚至陷入了矛盾和困惑的境地。近几年来,基因组学、蛋白质组学、代谢组学等现代科技的诞生似乎又给中医证候学的研究带来了新的曙光和前途。

1 中医证候实质研究的目的与思路的历史回顾

中医的 “证”是辨证论治的起点和核心。“证”是指在疾病的发生、发展过程中,一组具有内在联系的、能够反映疾病过程在某一阶段的病机,是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反映的一种功能状态。由于中医的证候是通过望、闻、问、切四诊所获得的一组有相互关联的症状和体征群的信息整理而得,缺乏客观指征,临床的把握上很大程度上依赖于医生的诊疗水平。

为此,许多学者期望依赖现代科学技术手段进一步阐明证候实质。在现代医学的“实证主义”和“还原论”思想指导下,人们希望通过证候物质基础的寻找,找到证候的特异性指标,探索证候的高特异性和高灵敏性指标,试图建立证候实验诊断单个金指标,从而实现证候的微观辨证依据。研究者不断从不同角度及层次研究与“证”相关的实验室指标。随着“证”本质研究的广泛深入开展,某些指标的特异性逐渐被否定,甚至许多观察指标出现了相矛盾的结果[1]。因此,人们看到现有的实验指标及单系统、单层次的研究已经难以全面揭示证候的科学内涵。

20世纪中叶以来,人类基因组学研究的方法和内容与中医学整体观、辨证观有许多相似之处。国家中医药管理局在中医现代化科技发展战略研究中,制订了证候研究的科研思路,其中提出了证候与蛋白质组学的研究。其理论依据是,“真核细胞生物基因功能复杂,但基因总要表达为相应的蛋白质才能产生生物功能,而且一般情况下,基因组只表达一部分基因,其表达类型均受到生存环境及内在状态变化的影响而有较大差异。因此采用对一个基因组的全套蛋白质,一个细胞乃至一个组织的全套蛋白质的蛋白组学研究方法进行证候研究具有更重要的意义”。国家自然科学基金 2006年中医药重大研究计划招标指南指出:“证候与疾病和方剂的相关性理论是中医基础理论建立的最根本问题”,围绕疾病证候病机和方剂的相关性这一中医证候研究的重要科学问题,突出中医学思维特征与现代科学设计融合的研究思路,以方剂干预的治疗效果作为参照标准,用蛋白质组学技术为研究手段,基于中医以方测证的逆向思维的认“证”方法,不断积累、完善,应能从蛋白水平上找到方证相应理论的物质基础以及解决“证”本质问题,构建出具有坚实临床科学基础的证候标准。

因此,近年来有学者提出利用基因组学、蛋白质组学研究中医证候的设想,并提出“证候基因组学”、“证候蛋白质组学”等概念,试图在分子水平描绘中医证候本质的全貌。就分子水平而言,证候不一,基因表达谱也不一样,“证”的本质是基因型及其表达,体外能用肉眼观察到的症状和体征变化具有其分子基础,是基因及其在 mRNA、蛋白质水平差异的外在表现,结合临床辨证分型,提出证候基因组学、证候蛋白质组学理论,提倡通过分子流行病学调查,综合 mRNA、蛋白质等多种分子生物学标志物,引入分子生物学方法、蛋白质组学方法。如 mRNA差异显示法、差异二维蛋白质电泳方法,从 mRNA、蛋白质水平探讨中医“证”的实质、证的分类、证的辨治、证的演变规律,阐明证的基因表型、蛋白质表形及其转化[2]。通过对正常及病变样本蛋白质组分差异的比较和相同疾病不同证型之间的比较,就有可能从整体上发现某些疾病或同病异证的特有蛋白质的表达,建立蛋白质多态性与疾病中医分型、辨证用药之间的系统的有规律的联系,在复杂的多种致病因素作用下找到证候的共同本质[3]。

中医证候实质的研究,其目的就是要用现代医学理论揭示中医证理论中蕴藏的科学内涵,阐明中医诊断和治疗各种证及其相关疾病的微观机制,学者们希望用现代科学技术的手段,找到中医证候的物质基础,以期阐明证候的科学内涵,期望如现代医学对某病的诊断一样,找到客观的指标。

2 冠心病中医证候与基因、蛋白质、代谢组学研究的现状

基因、蛋白质、代谢组学研究,给证候的进一步研究带来更多机遇与启示,但能否全面诠释证候的本质,沿着这一研究的目的和研究思路,我们最终能走到何处。为了达到科学研究的目的,必须有达到目的的正确的方法和手段,在这一研究过程中我们必须审视我们的研究思路。以冠心病为例,综合目前的研究需要我们冷静思考。

综观目前在冠心病证候学研究方面,许多学者进行了有益的探索。朱萱萱[4]等研究冠心病患者与健康人以及冠心病患者之间在代谢组学方面存在的差异。男性的 score plot图中,健康对照组、气虚血瘀证和痰阻心脉证相应集中在 3个不同区域,完全没有重叠,区分度很高。女性的 score plot图中,健康对照组、气虚血瘀证、痰阻心脉证和气阴两虚证相应集中在 4个不同区域,基本没有重叠,区分度也很高,提示代谢组学方法可能成为冠心病的病因病机以及中医辨证分型新的研究手段。刘卫红[5]等运用代谢组学技术,动态观察高脂血症向动脉粥样硬化发展过程中“由痰致瘀”的生化物质基础。高脂血症前期以脂质代谢紊乱为特点,即高脂血症痰浊的生化物质基础,随着病程进展,乙酰糖蛋白尤其是 O-乙酰糖蛋白的出现,说明凝血机制出现异常。由于参与血液凝固过程的纤维蛋白原、凝血酶原和几种凝血因子都是糖蛋白,因此乙酰糖蛋白谱峰的改变可能是高脂血症大鼠模型血瘀的早期生物标记物。同时脂肪产生热量供机体活动的需要时,脂肪分解产生酮体及能量代谢产生大量乳酸,使脂质代谢紊乱进一步加重,这与同时检测的血脂、血流变结果相一致。分析这些内源性代谢产物的形成、转移机制和过程,可提示痰瘀证候的动态演变、时相特点和由痰致瘀的条件,从而揭示其生物学本质。吴红金[6]等采集正常健康者、冠心病心血瘀阻证病人的血浆,用双向电泳、图像分析技术发现,冠心病血瘀证病人血浆与正常相比有 3个蛋白质下调和 6个蛋白质上调,用胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定,其中冠心病血瘀证病人血浆与正常相比升高的蛋白质有免疫球蛋白、纤维蛋白原、粒酶,与正常相比降低的蛋白有 CD44SP,而这些蛋白有望发展成为冠心病血瘀证病人血浆中的诊断标志物。赵慧辉[7]等采用 DIGE差异凝胶电泳和串联质谱对 8例冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者血瘀证程度变化前后及健康人的血浆进行蛋白质组学的比较研究。初步发现,Clusterin、ApoA-I在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者的血浆中,表达低于健康人,血瘀证程度变轻后表达增加。而 Fibrinogenβchain、VitaminD-Binding Protein、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者的血浆中,表达高于健康人,血瘀证程度变轻后表达降低。认为Clusterin、ApoA-I、Fibrinogenβchain、Vitamin DBinding Protein、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain可能与冠心病不稳定性心绞痛血瘀证相关。

另一方面,冠心病辨证分型目前没有统一标准,更何况王晓才等研究冠心病证候组合以三证组合最为多见,两证组合多为气虚血瘀证,三证组合多为气虚血瘀证合并阴虚证或痰浊证或阳虚证,四证组合多气虚血瘀阳虚证合并阴虚证或痰浊证或寒凝证,五证组合为气虚血瘀阳虚寒凝证合并阴虚证或痰浊证[8]。如此复杂的证候组合,并且许多中医的证候是根据中医理论,从理论推演而来,如气虚,有气虚下陷,宗气下陷,大气下陷等;又有肾不纳气等不同概念,又可分为肝气、脾气、心气、肺气,肾气等。并且血瘀证又结合脏腑有心血瘀,肝血瘀证等。

3 中医证候与基因、蛋白质、代谢组学研究的审视和思考

通过以上有关证候与基因、蛋白质、代谢组学研究情况的分析不难看出,虽然基因、蛋白质、代谢组学是从整体上研究疾病发生的机制,解决了以往研究的单一组织、单一器官、单一系统的研究方法,但是所采取的研究思路仍是还原分析方法研究证候概念,以寻找证候特异物质为目标,甚至是基因和蛋白质为指标。但据此法研究中医证候,可能又回到以往的老路,陷入以往还原分析方法的泥潭,以至于可能毫无功效。

中医的证候是根据中医理论推演而来,而在目前所进行的的研究中中医分型的标准不一,又加之证候组合复杂,无法就研究结果进行统一分析。

情志致病和心理因素在中医的证候学形成中占有重要位置。目前基因的结构和功能还难以阐明,诸如感觉、思维、意识等高级神经活动的机制。因此,单纯的基因、蛋白质、代谢组学对人的本质、证候本质的阐述都是不全面的[9]。

许多学者提出了证候研究应注意到病证结合研究。在证候本质研究中,证候受病的制约,证候与病之间呈交织网络的关系,即一证可见于多种疾病之中,一种疾病又可见若干证型。由于现代科学的发展,对疾病的认识也越来越深入,中医研究者也趋向于采用病证结合的模式进行研究,这样更容易使中医与现代科学找到契合点。所以我们应严格确立疾病的纳入、排除标准,使疾病单纯化[10];严格确立方剂的适应证,即证候纳入的辨证标准,严格筛选病例,为此证候规范化是实现中医学标准化和现代化的重要步骤,建立规范化的证候诊断标准是证候深入研究和多中心协作研究的前提和基础。

采用方证相关的研究方法,认为方证相关强调了方剂与其作用对象之间的相互作用,即方剂的功用是特定方药与其作用对象特定证之间相互作用的结果。方证相关也提示从单一角度对方或对证的研究,有可能背离中医学术的内在逻辑,而将方与证结合起来考虑则可大大提高研究效度[11]。并且提出了动态研究等的研究中应该注意的问题。但是中医证候的复杂性表明,对于证候的研究不能单纯使用西医学的手段和方法,证候与致病因素之间、与理化指标之间、与方剂效应之间都存在着非线性关系,这些非线性关系是导致多年来证候研究出现矛盾和困惑的根源。证候的定位是整体性和亚整体性的,从系统论角度而言,是机体系统质和功能子系统异常的外在表现,证候偏重于功能失调,是对机体整体功能反应状态的认识和把握[12]。

“证候是人体这个复杂巨系统在病理状态下的整体反应”,根据复杂系统的认识:复杂系统是由众多存在复杂相互作用的组分(或子系统)组成的,系统的整体行为(功能或特性)不能由其组分的行为(功能或特征)来获得。因此在证候与基因、蛋白质、代谢组学研究过程中,应该结合复杂系统的研究方法和思维,更应该认识到证候学研究需要我们正确的研究思路和研究的方法。

当研究的外部干预系统相对简单时,例如西药,可以归纳为扰动点,相当于“点”对“系统”的作用。但是当研究的外部干预系统本身是一个复杂系统时,例如中医方剂,现有的系统生物学尚不能与方证结合的整体化研究相适应。因此我们不仅要在中医药研究中应用系统生物学,而且要源于系统生物学和中医药学进行创新和提升,发展高于现有系统生物学、适合两个复杂系统相互作用研究的整体化方案,这也将反过来推动系统生物学和生命科学方法学的发展[13]。

系统生物学的研究思路和方法虽然与中医学的整体观和辨证论治有着许多的相似,但是采用拿来主义的方法和手段研究复杂的中医证候学问题,我们认为是值得我们冷静思考的,组学在中医研究中前景看好,但同时也面临许多问题和挑战。正是由于证候和中药的复杂性、整体性、动态性和异病同证、同病异证等特性,再加上由于种族、体质、饮食习惯、气候、地理环境、年龄、性别乃至患者的心理状况等诸因素也会影响证候表现的差异。因此,尽管病因、病位、病性基本相同,相同的证候又会表现出不同的亚型,又大大增加了证候组学研究的复杂性。

证候信息多具有模糊性和不确定性,应属于复杂巨系统范畴。单纯用直观、线性的方法研究证候,已不能适应中医证候研究的需要。复杂性科学、模糊数学、集对分析和计算机技术的发展给处理以定性描述为主的、动态不确定的信息——证候的内涵及其本质提供了可能。从复杂性科学角度研究中医药是近年来在中医学界兴起的新的研究热点,中医药研究中引入复杂性科学研究、非线性科学研究方法,它将对中医药的研究提供新的思路和方法,促进中医药研究的深入发展[14]。

我们必须对“证候实质”研究、证候物质基础研究的方向和目的进行深刻的理解和认识,只有吸收与创新,在中医理论特别是中医整体观指导下,运用现代科技思路、方法和手段,创新性地提升我们的研究的方法和思路。

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