牛传染性疾病诊断的国家标准、行业标准与国际标准的比较与适用性评估

史喜菊，马贵平，李冰玲，李炎鑫，刘全国

（北京出入境检验检疫局，北京 100026）

1 前言

国际动物卫生组织（OIE）制定的动物卫生标准是WTO中SPS协定唯一认可的动物卫生规则，作为技术法规和仲裁国际贸易纠纷的技术依据，得到了世界各国兽医工作者的一致认可。OIE的诊断标准体系完善、内容科学，有分布于全球的150多个参考实验室作为技术后盾，这些诊断技术代表了全世界兽医工作的最高水平，科学性、实用性和先进性都很强，是世界各国在兽医技术能力建设上所参照的国际标准。随着全球经济一体化进程的加快，动物和动物产品的国际贸易也进入了国际竞争时代，各国对动物的健康状况和卫生水平以及动物产品的安全性提出了更加苛刻的要求，一些国家借此设置各种贸易技术壁垒，限制别国的产品出口，以此实现贸易保护。

近几年来，在国家标准委和认监委的指导下，在各级动物防疫和口岸检验检疫机构以及广大制标人员的共同努力下，我国动物检疫标准的制修订工作取得了一定的成绩，但还没有建立起与国际接轨的动物卫生标准体系，用国际标准衡量时，我们所制定的标准的技术水平和内容的涵盖范围还有诸多不足，动物卫生标准化工作还远不能适应入世后的贸易和社会发展需要。为了应对国际贸易的需要，促进国家标准、国家法规的协调性特别是与国际标准的接轨，现以OIE规定的牛传染性疾病（18种）为例进行国家标准、行业标准与国际标准的比较，为动物检疫标准的制修订工作提供参考。

2 OIE规定的牛传染性疾病诊断的国家标准、行业标准与国际标准的比较

2.1 牛无浆体病（Bovine anaplasmosis）的诊断标准及适用性评估

牛无浆体病的OIE诊断标准包括涂片染色、核酸检测、竞争ELISA、卡片凝集试验、补体结合实验、间接ELISA、Dot ELISA以及间接荧光抗体试验，共计8个方法标准。其中涂片镜检适用于无浆体病急性感染期的检测，一些国家有商品化试剂盒供应；核酸检测技术敏感性非常高，可以检测带菌牛，但套式PCR存在非特异性扩增的问题；竞争ELISA可以检测持续感染动物，是无浆体病血清学诊断的首选方法，敏感性和特异性分别达到96%和95%，2.5h出结果，有商品化试剂盒供应；卡片凝集试验可以在实验室内或者田间进行，是无浆体病血清学诊断的首选方法，敏感，快速，几分钟出结果，但存在非特异性反应，结果解释带有主观性差异，批间或实验室间差异大；补体结合实验敏感性波动范围比较大，重现性差，大部分病原携带者不能被检出，不再推荐用于检测感染动物；间接ELISA是检测阳性血清的可靠工具，可以100%检出感染长达3年之久的阳性血清；Dot-ELISA快速、容易操作，成本低，敏感性和特异性分别达到93%和96%；间接荧光抗体试验每天检测的样品数量有限，存在非特异性荧光反应。牛无浆体病诊断的国家标准只有一个快速凝集检测方法，对应于OIE标准的卡片凝集试验，比较单薄，应该加强制修订工作。检验检疫行业标准包括涂片镜检、核酸检测、竞争ELISA、间接ELISA和Dot ELISA以及补体结合实验操作方法，检验检疫行业标准相对比较完善，除缺失的凝集试验有国家标准补充之外，只缺少了OIE标准中的间接荧光抗体试验。

2.2 牛布氏杆菌病（Bovine brucellosis）的诊断标准及适用性评估

OIE有关布氏杆菌病的诊断标准很多，包括病原鉴定5个（染色技术、病原培养、鉴定和分型、核酸检测、疫苗株鉴别）、血清学实验6个（玫瑰苯凝集、缓冲平板凝集、补体结合实验、间接ELISA、竞争ELISA、荧光偏振试验）及其他方法6个（皮内变态反应、血清凝集试验、天然半抗原和细胞溶质蛋白试验、牛奶间接ELISA、牛奶环状试验、gamma干扰素试验），共计17个标准方法，其中6个血清学方法都是国际贸易指定使用的方法。染色技术（形态学或免疫特异性组织染色）是布氏杆菌病的假定证据，但对于病原数量低的牛奶和奶制品敏感性低，脂肪球对结果解释也有干扰；病原培养是从病料中分离布氏杆菌，是本病的确诊试验；鉴定要靠细菌形态学和生化特征等联合应用，菌落形态观察对分型是必需的；核酸检测可以检测和鉴别布氏杆菌，进行种属鉴别和生物分型鉴定，区分疫苗株和感染株，是流行病学调查的工具，快速、简单、明确，解决了错误鉴别的难题；疫苗株鉴别是根据不同疫苗株各自的生化特性进行鉴别。玫瑰苯凝集是一种简单的斑点凝集试验，适合于快速筛选感染动物或者对无布病畜群进行无感染检疫，非常敏感，是国际贸易指定使用的方法；缓冲平板凝集非常敏感，特别适用于检测疫苗接种诱导产生的抗体，是国际贸易指定使用的方法；补体结合实验使用很广泛，是一般公认的确诊试验，但操作复杂，需要良好的实验室设施和训练良好的操作人员，特异性强，是国际贸易指定使用的方法；间接ELISA有商品化试剂供应，已经经过了广泛的田间验证，敏感性高，但不能区分免疫抗体和感染抗体，在检测感染动物时其敏感性等于或高于BBAT，是国际贸易指定使用的方法；竞争ELISA有商品化试剂供应，特异性比间接ELISA强，但特异性降低了，在检测感染家畜时其敏感性与BBAT和间接ELISA相当，是国际贸易指定使用的方法；荧光偏振试验敏感性和特异性与竞争ELISA相当，非常快速，适合于实验室内和田间使用，是国际贸易指定使用的方法。皮内变态反应适用于筛选未免疫接种畜群，也可以辅助解释血清学交叉反应结果特别是在无布病地区，特异性非常高，但并不能作为单独的诊断试验或用于国际贸易目的而推荐使用；血清凝集试验在牛布病的监测和控制计划中已经成功应用了很多年，但一般认为用于国际贸易目的使用效果不理想；天然半抗原和细胞溶质蛋白试验高度特异，与RBT快速筛选试验一起成功地用于布病根除计划，最佳敏感性接近于CFT，但低于RBT和I-ELISA；牛奶间接ELISA敏感而特异，特别适用于大规模畜群的检测，有几种商品化试剂盒供应，并且都已经经过了广泛的田间试验验证，正在广泛使用；牛奶环状试验是ELISA的适当替代方法，用于泌乳动物畜群布病的筛查；gamma干扰素试验很有用，但是需要特异性较强的抗原，程序也要标准化。有关牛布病诊断的国家标准属于空白，检验检疫行业标准包括4个，分别对应于OIE标准的补体结合反应、平板凝集试验、牛奶环状试验和血清凝集试验，缺失了OIE标准中的其余13个方法，与OIE标准差距比较大，建议加强这方面的标准制修订工作。

2.3 牛生殖道弯曲杆菌病（Bovine genital campylobacteriosis）的诊断标准及适用性评估

牛生殖道弯曲杆菌病诊断的OIE标准包括病原分离、种属鉴定、免疫学鉴定、生化鉴定和分子生物学鉴定及ELISA，共计6个方法标准。其中病原分离和鉴定是确诊方法，是国际贸易指定使用的方法；免疫学鉴定技术可以直接从样品中鉴定抗原，对分离株进行鉴定，但不能区分亚种，是国际贸易指定使用的方法；生化鉴定可以鉴定亚种，是国际贸易指定使用的方法；分子鉴定可以鉴定亚种，但比较耗时，而且需要昂贵的设备和专业知识；ELISA检测抗原特异性分泌抗体和疫苗接种后的血清抗体。相关国家标准属于空白；检验检疫行业标准包括OIE标准中的病原分离、种属鉴定和生化鉴定方法，缺失了OIE标准中的免疫学鉴定和分子鉴定及ELISA试验，差距较大，建议加强这方面的标准制修订任务。

2.4 牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy）的诊断标准及适用性评估

牛海绵状脑病诊断的OIE标准包括组织病理学检查、免疫组织化学检查、蛋白免疫印迹方法、快速筛选试验和SAF电镜检查，共计5个方法标准。其中组织病理学检查适用于福尔马林固定的牛脑组织，是牛海绵状脑病诊断的基础，可以加速疾病的诊断，但已经不再是调查疑似动物或对健康畜群进行快速筛选的首选方法；免疫组织化学检查适用于福尔马林固定的牛脑组织，是牛海绵状脑病监测和确诊的黄金标准，在全世界广泛使用；蛋白免疫印迹试验适用于未固定的新鲜牛脑组织，敏感性与免疫组织化学相当，是确诊本病的黄金标准，在全世界广泛使用；全自动快速蛋白免疫印迹和ELISA筛选试验适用于大量脑组织样品的快速筛选，有商品化试剂供应；SAF电镜检查成功地用于福尔马林固定的脑组织，死后出现组织自溶无法进行组织病理学检测时特别有用，动物接种试验可用于检测BSE的感染性，但不能用于常规诊断。牛海绵状脑病诊断的国家标准和行业标准都包括组织病理学检查和免疫组织化学检查2个方法，缺少了OIE标准中的蛋白免疫印迹试验和快速筛选方法，建议加强这些标准的制修订工作。

2.5 牛结核病（Bovine tuberculosis）的诊断标准及适用性评估

牛结核病诊断的OIE标准包括显微检查、病原培养、核酸鉴别、皮内结核菌素测试、gamma干扰素试验、淋巴细胞增殖试验和ELISA试验，共计7个标准方法。其中显微镜检查可以对疾病做出假定诊断，病原培养适用于结核菌素或gamma干扰素检测阳性动物在尸体剖检时没有发现可见的病理变化，建议采集头部和胸部的混合淋巴结样品进行培养，根据特征性生长模式和菌落形态进行假定诊断；核酸鉴别对分离菌株进行快速鉴别和基因分型，具有重要的流行病学价值，有商品化试剂盒供应，但实验室间比对还不充分；动物接种是确诊结核病的重要依据；结核菌素试验是检测牛结核病的标准方法，可用于区分牛分支结核杆菌感染动物和其他分枝杆菌感染动物，但敏感性达不到100%，单靠结核菌素实验不可能从畜群中根除结核病，在大多数非牛科和非鹿科动物的应用还没有很好地确认，是国际贸易指定使用的方法；gamma干扰素试验具有检测早期感染的能力，动物只需要保定一次，已经批准用于很多国家的结核病根除计划，在一些国家用作连续试验来增强特异性，用作平行试验来增强敏感性，有商品化试剂盒供应，但经过评价的应用动物种属有限，是国际贸易指定使用的替代试验；淋巴细胞增殖试验比较耗时，实验室操作比较复杂，用于野生动物和动物园动物是有用的，用于鹿结核杆菌病的检测敏感性和特异性都很高，具有科学价值，但是不能用作常规诊断，试验成本相对较高，还未进行实验室间比对。ELISA试验可用于检测野生动物，在缺乏gamma干扰素试验和皮肤试验不可靠的地区，ELISA用于动物结核病的检测非常有用，但用于牛时敏感性相对较低，USA目前已经准许该实验用于大象和非人类灵长类动物，英国批准用于獾；是最适当的抗体检测方法，是细胞免疫反应试验的补充而不是替代，简单，但敏感性受限制。有关牛结核病的国家标准包括染色镜检、病原培养、动物实验及皮内变态反应，其中动物接种试验是对OIE标准的补充，缺少了OIE标准中的gamma干扰素试验、淋巴细胞增殖试验和ELISA，相关检验检疫行业标准仍属空白，建议加强这方面标准的制修订工作。

2.6 牛病毒性腹泻黏膜病（Bovine viral diarrhoea）的诊断标准及适用性评估

牛病毒性腹泻黏膜病诊断的OIE标准包括病毒分离、ELISA检测抗原、免疫组织化学、核酸检测、病毒中和试验及ELISA，共计6个方法标准。其中病毒分离是国际贸易指定使用的试验，微量板免疫过氧化物酶方法用于血清样品中病毒检测的大量筛选，试管培养法用于组织或白细胞上清液或者精液样品；ELISA抗原检测适合于检测持续感染动物，不适合于急性感染的病毒检测，在持续感染合并血清阳性反应的病例稀少地区是首选方法，最好的方法敏感性等同于病毒分离，有商品化试剂盒供应，是国际贸易指定使用的方法。免疫组织化学检测组织切片上的病毒抗原，皮肤活检特别是耳切样品对于持续性感染的体内诊断很有价值。RT-PCR适用于诊断目的的病毒检测和怀疑有低水平病毒污染时的批量筛选，多重PCR用于从病毒培养物或者从血液中扩增病毒并进行病毒分型，原位杂交适用于福尔马林固定的石蜡包埋组织，可以进行回顾性分析，也可用于系统进化分析，核酸检测容易污染，一定要设严格的对照。病毒中和试验检测血清抗体，没有一个毒株可以满足所有情况，应该选择能够在本地牛中可以最高比例检测到血清反应的毒株。有间接和阻断ELISA两种，牛奶样品中ELISA抗体检测结果是畜群BVD地位的有用指示，有商品化试剂盒供应。有关牛病毒性腹泻黏膜病的国家标准包括病毒分离、鉴定与微量血清中和试验，检验检疫行业标准包括抗原捕获酶联免疫吸附试验、病毒分离、微量血清中和试验以及反转录聚合酶链反应，缺少OIE标准中的免疫组织化学技术和ELISA抗体检测，与国际标准比较接近。

2.7 牛传染性胸膜肺炎（Contagious bovine pleuropneumonia）的诊断标准及适用性评估

牛传染性胸膜肺炎诊断的OIE标准包括病原鉴定9个（病原培养、生化试验、核酸检测、间接荧光抗体试验、荧光抗体试验、圆斑生长抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散试验、斑点免疫结合试验和免疫组织化学试验）和血清学实验5个（补体结合实验、竞争ELISA、免疫印迹试验、玻片凝集、乳胶凝集），共计14个方法标准。其中病原培养适于从活动物或者尸体剖检采样进行检测，困难、耗时；生化试验用于免疫学实验和PCR结果不确定的情况下，应该由参考实验室实施；核酸检测是鉴别病原的主要工具，可用于保存较差的样品，敏感、快速，操作简单，容易污染，操作要小心。间接荧光抗体试验用于胸膜涂片效果良好，肺涂片效果不满意，存在非特异性荧光染色；荧光抗体试验用于肉汤和琼脂培养物，特异性不如间接荧光抗体染色；圆斑生长抑制试验操作简单，但一些结果的解释需要经验；琼扩试验用于胸膜液、肺碎片或坏死骨片中的抗原，敏感性不够，特异性未知，用作筛选试验；斑点免疫试验适用于实验室的日常鉴别，免疫组化只是对其他诊断的补充，阴性结果不具有确定性。补体结合试验被疫区国家广泛用于本病的筛选和根除计划，操作困难，需要经过良好训练和有经验的工作人员，更适合检测急性发病动物，是国际贸易指定使用的方法，也适用于无疫病区的认定。竞争ELISA经过了热带国家的评估可用于本病的筛选和根除计划，敏感性与补体结合试验相当，特异性更强，是国际贸易指定使用的方法，有商品化试剂供应，重复性好，任何国家都适用。免疫印迹试验具有诊断价值，田间评估显示比补体结合试验敏感性更高、特异性更强，主要用作确诊试验。玻片凝集试验只在畜群基础上使用有效，敏感性不够，只能检出急性发病动物，乳胶凝集比玻片凝集更加容易解释。牛传染性胸膜肺炎诊断的国家标准包括病原鉴定、补体结合试验和微量凝集试验，检验检疫行业标准包括病原分离鉴定和补体结合实验，其中病原鉴定和补体结合是对国际标准的对应，微量凝集试验是对国际标准的补充，缺失了OIE中的其余12个方法，与国际标准差距很大，建议加强这方面的标准制修订工作。

2.8 牛地方流行性白血病（Enzootic bovine leukosis）的诊断标准及适用性评估

牛地方流行性白血病诊断的OIE标准包括病毒分离、PCR、ELISA和琼脂免疫扩散试验，共计4个方法。其中PCR适于检测个体动物的白血病病毒，不适合于群体检测，敏感性高，容易引起假阳性，可用作血清学试验的辅助手段进行确诊。间接ELISA适合于检测混合牛奶样品中的抗体，阻断ELISA适合于检测单个或混合血清样品中的抗体，都有商品化试剂盒供应，是国际贸易指定使用的方法。琼扩试验检测个体动物血清样品中的抗体，敏感性不高，简单、容易操作，用于疾病的根除计划非常有效，有商品化试剂盒供应。目前还没有关于牛白血病诊断的国家标准，检验检疫行业标准包括PCR和琼脂免疫扩散试验2个，分别对应于OIE标准的PCR和琼扩试验，缺失了OIE标准中的病毒分离和ELISA，建议加强这方面的标准制修订工作。

2.9 牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis）的诊断标准及适用性评估

牛传染性鼻气管炎诊断的OIE标准包括病毒分离、抗原检测、核酸检测、荧光PCR、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验，共计6个方法标准。其中从牛精液中分离病毒是国际贸易指定使用的方法，抗原检测在组织涂片上进行直接或间接荧光抗体试验，冷冻切片还可以确定抗原位置，不需要细胞培养设备，实验室诊断在1天内可以完成，缺点是敏感性较低，如果需要进行深入研究还需要再进行病毒分离。核酸检测主要用于人工或自然感染牛精液及其他临床样品中病毒 DNA检测，敏感、快速，但易污染，需要采取防范措施预防假阳性；荧光PCR从牛精液样品中检测病毒DNA已经经过了确认，特异性更强，敏感性达到套式PCR的水平，污染的风险更低，可以进行定量，是国际贸易指定使用的试验。病毒中和试验是检测血清抗体最敏感的方法，是国际贸易指定使用的试验，ELISA检测血清和牛奶样品中的病毒抗体，有逐渐取代病毒中和试验检测抗体的趋势，是国际贸易指定使用的方法，有很多商品化试剂供应。目前还没有关于牛传染性鼻气管炎的国家标准，农业行业标准包括病毒分离、微量血清中和试验和ELISA 3个，检验检疫行业标准包括病毒分离、核酸检测、ELISA和病毒中和试验4个，分别对应于OIE标准中的病毒分离、核酸检测、病毒中和以及ELISA，缺失了OIE标准中的抗原检测和荧光PCR，建议加强这方面的标准制修订工作。

2.10 牛锥虫病（Trypanosomosis）的诊断标准及适用性评估

牛锥虫病诊断的OIE标准包括鲜血涂片、厚血涂片、薄血涂片、血细胞比容离心、暗视野/相差血沉试验、阴离子交换、体外培养、动物接种试验、抗原检测、DNA检测、荧光抗体试验以及ELISA，共计12个方法标准。其中鲜血涂片简单、便宜，即刻出结果，但敏感性低；厚血涂片简单、便宜，但耗时长；薄血涂片特异性强，可以进行种属鉴别。血细胞比容离心比直接检测技术更加敏感，直接出结果，广泛用于大批量筛选，种属鉴别比较困难；暗视野/相差血沉试验检测能运动的、有活力的锥虫，直接出结果，广泛用于筛选大批量动物，敏感性强，能够更加准确地进行种属鉴别和永久保存，但成本昂贵。阴离子交换技术敏感性很高，但比较繁琐、昂贵、耗时，不适用于大批量检测；体外培养技术非常高效和敏感，需要精密设备，耗时长，不适合于大规模使用，不能进行种属鉴定；动物接种试验比直接血涂片敏感，但比较昂贵，耗时长，实用性差；抗原ELISA的田间评价是在受控条件下得出的，其敏感性和特异性都不适合于锥虫病的诊断；PCR方法是人类和动物感染非洲锥虫的诊断工具，敏感性强，容易出现假阳性，不能识别所有分离株，成本高限制了该方法的常规使用；荧光抗体试验具有属间特异性，可以检测当前或既往感染，对主动感染只能提供假定诊断，需要昂贵的精密仪器和专家，只能在专业实验室使用，周期长；ELISA可以自动化和标准化，适合于大规模流行病学调查。牛锥虫病诊断的国家标准包括鲜血涂片、薄血涂片、毛细管集虫、实验动物接种、乳胶凝集试验、间接血凝试验和ELISA共7个，检验检疫行业标准只有一个补体结合实验，其中5个方法与OIE标准相对应，乳胶凝集试验、间接血凝试验及补体结合试验是对OIE标准的补充，缺失了OIE标准中的厚血涂片、暗视野/相差血沉试验、阴离子交换、体外培养、抗原检测和DNA检测，建议加强和完善这方面的标准制修订工作。

2.11 与国际标准差距非常大的几种牛病

OIE规定的牛传染性疾病共有18种，除上述10种之外，还包括牛巴贝西虫病（Bovine Babesiosis）、牛囊虫病（Bovine Cysticercosis）、牛嗜皮菌病（Dermatophilosis）、牛出血性败血病（Haemorrhagic septicaemia）、牛结节性皮疹（Lumpy skin disease）、牛恶性卡他热（Malignant catarrhal fever）、牛泰勒焦虫病（Theileriosis）以及牛毛滴虫病（Trichomonosis）8种，这8种传染病的国家标准及行业标准都属于空白，而相应的OIE标准内容都很丰富、方法的先进性和科学性都很强，一旦需要对这些疾病进行检疫，我们的工作就会陷入被动，建议尽早做好技术储备，加强这方面的标准制修订工作，以便能适应国际贸易的需要。

3 比较结论与建议

通过比较与评估发现，我国的牛传染性疾病检疫技术标准与国际标准存在不同程度的差异。具体表现在:（1）有一些标准是OIE手册中没有提及的，如牛结核病动物接种试验、牛传染性胸膜肺炎微量凝集试验以及牛锥虫病微量凝集试验、间接血凝试验和补体结合实验等，这些标准都是我国相关科研单位根据国家牛传染性疾病发生的实际情况而制定的。这样做提升了标准的适用性，更加符合动物疫病防控的迫切需要，是对国际标准的补充，如果技术成熟，建议申请国际标准认可。（2）有一些标准内容比较全面，技术含量高，科学性强，具有一定的先进性，与国际标准比较接近，可以满足国际贸易的需要，如牛无浆体病、牛病毒性腹泻黏膜病。（3）有一些标准内容不全面，只包括了OIE标准中的部分内容，落后于国际标准，特别是OIE推荐的国际贸易规定要使用的方法在我国缺失，这类标准要加快修订和更新，以便能适应国际贸易的需要，如牛地方流行性白血病的ELISA试验。（4）有一些标准与国际标准差距很大，比较成熟的国际标准在我国还是空白，这种情况是最令人担忧的，必须加快这方面的标准制修订工作，如上述2.11所列疾病。

针对上述我国牛传染性疾病检疫标准与国际标准存在的差距，建议（1）从OIE参考实验室引进重大牛病的诊断试剂和方法，选取国内资质条件好的实验室对目前我国已经制定的牛病检疫标准进行验证和复核。验证合格者，推荐使用，并推荐申请OIE的国际认可；验证有小幅差距者，暂停使用，待完善达标后再推荐使用；不合格者，停止使用，撤消标准。这样做有利于提高我国口岸动物检疫实验室的水平，有利于我国动物检疫标准与国际标准同等地位的确立，可以推动我国动物及动物产品的出口贸易，同时更好地防范外来动物疫病入侵，更好地把好国门。（2）遵照OIE标准的要求，制定一个系统、完整的国家标准或行业标准制定体系或框架，在该体系或框架的指导下，对现有标准进行清理整合、特别是对于那些内容交叉重复甚或矛盾的部分进行彻底清理，内容陈旧的标准进行更新修订，过期或不适用的标准进行作废处理，缺失的标准加紧制修订，使我国的标准制修订工作逐步进入一个有序状态，按计划进行。