Gamma 射线在骨科植入材料消毒灭菌中的应用进展

丁宇，阮狄克



Gamma 射线在骨科植入材料消毒灭菌中的应用进展

丁宇，阮狄克

100048 北京，解放军海军总医院骨科

近年来，骨科移植材料广泛应用于脊柱四肢骨折或缺损、人工关节返修、骨质疏松（可注射骨移植材料）乃至运动伤等方面的治疗。移植材料的应用避免了与自体组织移植相关的一系列缺陷，如供区的疼痛及可能的并发症、移植组织质量或数量的不确定性、形状或大小的限制等。然而，由于检测手段的局限，异体组织移植仍存在传播细菌、病毒或朊病毒致潜在危险疾病的可能，从而促使人们采取各种措施以尽可能多地杀灭病原微生物[1]。

目前大多采用的灭活病原菌方法均有一定的缺陷，如有机溶剂/表面活性剂消毒法只对表面病原菌有效，且操作复杂；热力消毒法对组织生物学活性影响较大；环氧乙烷作为广谱、高效的气体消毒剂，对消毒对象的穿透力强，可达到组织深部，但对组织的毒性作用及致癌性不可忽视。电离辐射是一种良好的冷灭菌方法，在国外已常规作为体内移植物植入前的处理手段，其优点为射线穿透力强、杀菌谱广、作用均匀、基本无害。60Co γ 射线照射是最为常用、便捷的灭菌方法之一，其消毒效果与辐射剂量有关，辐射剂量越大，灭菌效果越好，但会影响到组织的生物活性[2]。

1 γ射线照射消毒方法的应用及其剂量的选择

1949 年第一家全方位服务的组织库在美国成立，此后各组织库通过网络建立了国际间的交流合作，以满足迅速发展的组织器官移植的需要。这些组织库提供了大量骨科移植材料（如异体肌腱、大块异体骨及骨碎片等），在重建骨关节功能、填充骨缺损方面起到了重要作用。在标本采集过程中，虽然对供体有非常严格的筛选制度以及无菌操作措施，异体材料的污染仍不能完全避免。据统计，活体供应组织的污染率约为 2.7% ~ 22%，而尸体供应组织的污染率约为 6.6% ~ 53%[3-4]。目前针对包括异体骨在内的医疗产品的终末消毒，多采用高能量γ 射线照射的方法，可在常温下对不耐热物品灭菌，故又称“冷灭菌”。为提高γ 射线消毒灭菌的安全性及有效性，实际操作中倾向于减小辐射剂量，同时注重控制辐射条件，如周围填充惰性气体、降低灭菌环境温度、冷冻消毒产品、应用辐射保护剂及增敏剂等。

在选择γ 射线辐射剂量时，除考虑到移植材料中的细菌污染机率外，还应包括检测到的病原微生物数量、类型以及照射处理的组织等综合因素。通常认为，γ 射线辐射的剂量为国际原子能机构（International Atomic Energy Agency，IAEA）所建议的 25 kGy[4]，但针对该标准剂量一直存在争论。一些学者认为 25 kGy 的辐射剂量不足以杀灭骨移植物所携带的病原微生物，需要 30 kGy 或者更高剂量的射线辐射[5]；而另有证据显示超过 20 kGy 的电离辐射会对骨基质蛋白及骨生物力学强度造成破坏，故而有些组织库趋于选择较小的射线辐射剂量（15 ~ 20 kGy）。近来随着组织采集、保存及运输等环节的技术改进，移植物被致病微生物污染的可能性大为减小，适当降低辐射剂量可在保证消毒灭菌效果（sterility assurance level，SAL）的同时，最大限度地减少射线对组织的损害。一些学者参照 ISO 标准对骨科材料的射线消毒剂量做了修订，并证实理想的射线消毒剂量可以远远低于 25 kGy，而仍可保证 SAL 达到 10-6级别[2, 4, 6]。

在易污染骨移植材料的微生物中，除非致病菌外，也存在高致病性、强抗辐射性的细菌。最常见的污染骨组织的细菌株为葡萄球菌，包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌及相关类似菌株。在培养样本、股骨头细菌培养阳性及自尸体采集的异体骨中，致病葡萄球菌污染机率分别占 25/55（45%）、19/24（79%）及 12/34（35%）[7]。研究发现，细菌的毒性与它们的抗辐射能力并不是一致的，多数骨材料的致病菌对γ 射线较为敏感，而非致病性耐辐射奇球菌却可以耐受 15 kGy 的 γ 射线急性照射而不致死亡或诱导突变。细菌抗电离辐射的能力通常以 D10值（即杀灭 90% 菌株所需射线的剂量）表示，在 0 和–20 ℃时，金黄色葡萄球菌 D10值分别为（0.51 ± 0.02）及（0.88 ± 0.05） kGy，而大肠杆菌 D10值分别为（0.39 ± 0.04）及（0.98 ± 0.23）kGy[8]。致病菌中抗辐射能力最强的当属芽孢杆菌，其中短小芽孢杆菌的 D10值为 1.75 kGy，故而常以该类细菌的杀灭率作为设定射线辐射剂量的参考指标[4]。

人体组织库发展的起始阶段，主要依靠终末消毒来保证骨科植入材料的安全性，往往忽略了组织采集及处理的整个过程；继而，人们认识到电离辐射不能作为异体材料灭菌消毒的唯一手段，而应考虑到供体的广泛筛选及处理过程。随着组织库网络的发展，实际供需与材料采集运输等技术手段进一步提高，质量控制系统已大为改善，这其中包括供体选择、组织回收、处理、储存和运输等诸多方面，移植材料必须通过每一阶段的标准测试才能被下一阶段所接受。特别是近年来国际原子能机构及美国食品与药品管理局颁布了一系列规章及相关标准，要求组织库制定各自的操作流程，详细说明所有的生产细节。对于应用特殊辐射剂量的个案，其安全性事先必须经由相关实验验证。这样，最终的成品材料也就更为安全有效。如在过去的几年内，羊膜材料上的菌株由 1400 个菌落单位（cfu）下降到 120 个，而自 1996年以来骨移植材料上的菌落数几乎为零。取材前通过对供体进行医疗及社区范围内的筛选、HIV 抗体检测、淋巴结活检或尸检，HIV 病毒污染骨移植物的机率可以降到0.00006%[9]。IAEA 指出，如果移植物本身检测菌株数量小于 1000 个菌落单位，则用于终末消毒的射线辐射剂量可大大低于 25 kGy[10]。

总之，利用γ 射线对骨科植入材料进行终末消毒是普遍应用的有效方法，但考虑到医用产品的生物学特性，单纯将工业产品的处理标准应用于医疗产品是不合适的。对于正规组织库来说，在认可 25 kGy 辐射剂量的安全性及有效性的前提下，多倾向于选择更低等级的辐射剂量，以 15 ~20 kGy 的电离辐射消毒更为实用。

2 γ射线照射处理后骨科植入材料的生物学特性

目前普遍认为接受γ 射线照射的骨及软组织的生物学特性均具有“剂量依赖性”，即较高剂量的电离辐射会造成较大的组织生物学损害，反之亦然。γ 射线照射致组织损害的机制主要有两个方面：在干燥状态下，射线可直接损伤组织、造成肽链断裂；另外，射线还可作用于水分子释放自由基，进而引起胶原蛋白的变性[3, 6]。

骨基质中的胶原蛋白对于骨的抗压性是至关重要的，在骨的加载应力区，完整的胶原纤维可以为骨基质提供桥接及强化作用。射线辐射改变了胶原蛋白的结构，从而大大降低了骨的塑形适应性能（如骨的强度及韧性）。超显微结构的研究表明，经照射处理的移植骨骨折区域未发现胶原纤维的桥接现象，即崩解的胶原纤维无法将加载应力传递到整个骨基质[6, 11]。在异体骨的处理及消毒过程中，γ 射线照射被认为是最具破坏性的因素之一，如冷冻的小牛皮质骨（8 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 大小）经（30 ± 3）kGy 照射后，其生物力学强度比对照组下降了 25% ~ 50%；而兔胫骨照射处理后，其最大扭力矩及抗压强度分别下降了 23% 和 25%[6]。Currey 等[12]报道 25 kGy γ 射线照射可明显降低骨强度，虽然 25 ~ 30 kGy 的电离辐射对骨的杨氏弹性模量没有太大影响，但其塑形适应性能会逐渐降低。虽然骨的硬度没有明显改变，但其脆性增加，骨吸收创伤能量的性能会明显降低，对抗骨折的能力可降至正常骨的 20% ~ 30%。

目前普遍认为异体骨强度与射线照射剂量密切相关，如当射线辐射剂量为 17 kGy（低等级剂量）、29.5 kGy（标准剂量）及 94.7 kGy（高等级剂量）时，测试骨抗弯强度分别下降了 10%、20% 及 50%，而其对抗骨折强度分别下降了30% ~ 40%、40% ~ 50% 及 90% 以上[12]。Hamer 等[13]分别应用 0、6.8、9.5、16、23 及 60 kGy 剂量的γ 射线照射处理异体骨，显示在 23 kGy 剂量内处理的骨强度降低幅度较小，而经 60 kGy 照射后，骨强度显著降低。当射线照射剂量在 25 kGy 以下时，异体骨强度与射线剂量间未证实存在有明显相关性，但与较高剂量的射线辐射成明显负相关。而另一方面，适当γ 射线照射处理的异体骨在活体内的诱导成骨作用不会受到太大影响。早期的研究显示，较高剂量的电离辐射（30 ~ 50 kGy）还可在一定程度上增加脱钙骨基质的诱导成骨活性[14]，但随后的研究结果却大相径庭。Munting 等[15]发现经 20 ~ 40 kGy 辐射处理后，异体骨的诱导成骨作用明显减弱，植入骨几乎全部被吸收而未观察到新生骨，其骨胶原亦易溶解吸收；Kluger 等[16]发现经 25 kGy 照射处理的脱钙骨置入活体后，其对骨缺损部位的修复能力为对照组的 57%；而 Glowacki[17]报道经 20 ~ 40 kGy 照射处理后的脱钙骨仍可保持 80% 的生物学活性。

虽然诸多体外实验表明经辐射处理后移植物本身的生物学性能会有不同程度的下降，但这并不意味着临床实际疗效较差。研究显示经 25 kGy γ 射线辐射后，移植骨骨不连发生率及再骨折率并无明显增加，其在移植骨材料及脱钙骨基质中的诱导成骨作用均维持在正常水平。Hernigou 等[18]对 127 例经 25 kGy 照射的大块异体骨植入病例进行了3 年的随访，出现骨折或不愈合等并发症的发生率为 5.5% ~ 6%，接近于未经照射处理对照组。与之相反，Lietman 等[19]研究发现经照射处理的异体骨植入后骨折率为38%，是非照射组的 2 倍。因为上述两组临床研究的设定条件有较大差别，除照射本身的因素以外，诸如供受体年龄、疾病及植骨类型、内固定技术、辅助治疗手段、术后负重时间等多方面因素都会影响到临床疗效，故对该类研究的结果很难作出确切评判。另外，目前股骨远近端及胫骨近端应用异体骨移植病例趋于增多，在重建髋、膝等大关节时同时需要皮质骨及松质骨，其中松质骨主要受到压应力的作用，故电离辐射对松质骨生物力学性能的影响也受到人们的关注。研究表明松质骨比皮质骨更能对抗电离辐射，可以耐受 10、31 甚至 50 kGy 的γ射线照射而保持其生物力学强度；但当辐射剂量超过 60 kGy 时，松质骨表现为骤然的强度下降，仅为对照组的 23.9%[20]。

Balsly 等[2]将组织冷冻后接受低等级辐射剂量（18.3 ~ 21.8 kGy）或中等级辐射剂量（24.0 ~ 28.5 kGy）的γ 射线照射，显示骨组织可以耐受两种剂量的辐射，仍可保持较为理想的机械强度及弹性模量，而软组织（髌韧带、半腱肌、胫前肌、筋膜）可以在低等辐射条件下保持良好的生物力学特性。针对骨-肌腱-骨复合体的研究显示[21]，经 20 ~ 30 kGy γ射线照射处理后，其最大拉力强度下降了 11% ~ 27%，而经 40、60 及 80 kGy 照射处理后，复合物强度分别下降了 37%、68% 及 76%。肌腱组织抗拉力强度与射线照射剂量呈现非线性关系，27、37 kGy 的辐射剂量可致肌腱强度分别下降 20%、65%。Haut 等[22]认为如处理异体肌腱的射线辐射剂量为 20 kGy，组织的生物学性能即发生改变，尤其易致骨-肌腱结合部位撕脱；当γ射线辐射剂量大于30 kGy，则整个肌腱组织的生物学性能会发生明显改变。国内孙康等[23]进行了 25 kGy γ 射线照射与非照射同种异体骨-髌腱-骨重建前交叉韧带的临床前瞻性研究，发现前者关节稳定性较差，建议慎用。Goertzen 等[24]研究表明，在低温冷冻及氩气体环境中，肌腱组织可以耐受 25 kGy 的电离辐射，植入动物体内一年后，移植肌腱仍能保持较为理想的机械强度及神经生物学特性。但 Fideler 等[25]发现 20 ~ 25 kGy 的电离辐射并不能有效杀灭肌腱组织内的 HIV 病毒，建议选择 30 ~ 40 kGy 的辐射剂量。在尽量保证组织生物学完整性的前提下，Grieb 等[3]研究了优化处理异体肌腱的可能性，首先使用辐射保护剂对半腱肌进行预处理，然后在低温条件下进行高剂量（50 kGy）辐射灭菌消毒，结果显示肌腱尚能保持较为理想的生物力学特性，但仍需体内实验进一步验证。

3 γ射线照射效果的相关影响因素

γ 射线以其强穿透力有效杀灭细菌、病毒等病原微生物，但同时会对组织造成损害，其程度不但与辐射剂量有关，还易受周围环境的影响。人们目前多采取将标本干燥、冷冻或应用辐射保护剂、敏感剂等辅助方法，以尽量减少自由基的产生，维持组织的生物学性能。

理论上讲，干燥或冷冻后组织中水分子的流动性降低，射线辐射所产生的氧自由基会相应减少，因而对组织的损伤程度亦会降低。研究显示[26]，与室温条件下相比，–78 ℃环境中电离辐射对骨组织的损害明显减轻，表现为骨的脆性下降及较少的胶原成分破坏。相对于室温环境，在低温条件下经电离辐射的骨组织基质成分的破坏程度减轻，故能保持较理想的诱导成骨作用。然而，针对异体肌腱组织的研究与异体骨并不完全一致[27]，研究显示γ 射线辐射可致异体肌腱组织中的胶原蛋白含量减少，而其中干燥状态比新鲜状态下胶原蛋白的破坏更为严重，肌腱组织中羟脯氨酸的测定与其中水分含量并没有直接相关性。经电离辐射后，冷冻干燥或新鲜冷冻的肌腱组织植入体内早期可增加新型胶原的生成，从而促使异体肌腱的重塑，但随着时间延长，移植肌腱的机械强度会逐渐降低。此外，有人在照射组织周围充填惰性气体，以消除空气中的氧分子电离所产生的氧自由基，亦有利于保持肌腱组织的生物学性能[24]。

辐射保护剂的应用有利于消除或减轻自由基对组织的损伤，目前较多选择L-半胱氨酸的衍生物，它们的分子式中均含有–SH 结构，可以用来中和–OH；同时，作为一种天然氨基酸及人体必需营养素，半胱氨酸具有无毒性、易溶于水、生物相容性好及分子量小、较易穿透组织结构等特点，其衍生物亦多为无毒性或低毒性[28-29]。应用辐射保护剂后，γ 射线照射处理的异体骨在对抗屈曲外力、防止骨折及疲劳损伤等性能方面均有明显改善，分别为单纯照射组的 1.9、3.3 及4.7 倍，但仍未达到未经照射组水平[30]。在应用辐射保护剂组，可以检测到较多完整的ɑ- 链，提示胶原蛋白破坏程度明显减轻，有利于维持组织的机械强度。另一方面，辐射保护剂在保护组织生物学活性的同时，也可能为病毒或细菌提供了屏障作用，辐射增敏剂却可在一定程度上提高 γ 射线的消毒灭菌效果。溴化铵是常用的辐射增敏剂之一，水溶性，室温下稳定，可以特异性地绑定病原微生物的 DNA 而增加其对射线的敏感性[29]。但目前对于辐射保护剂及增敏剂联合应用的效果尚没有明确结论，还需进一步研究。

4 展望

γ 射线对骨科植入材料的终末消毒具有安全可靠、简便易行的特点，已倾向于作为国际通用方法及必需的处理过程。随着相关技术手段的进步及操作流程的规范，移植物质量及消毒灭菌效果得到进一步提高，所需射线辐射剂量相应降低，有效保持了照射组织的生物学活性。近年来骨科植入材料的种类日趋增加，除常见的骨与肌腱外，γ射线已逐渐或必将用于异体半月板、椎间盘等组织的终末消毒。另外，γ 射线还可用于组织工程支架的改造及塑形，如有助于调整水凝胶的物理及生物学性能（机械强度、孔径大小、表面形状、亲水性等），但仍需进一步优化相关技术参数[31]。

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丁宇，Email：cosmos.ding@yahoo.com.cn

2009-12-21

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.011