免疫原快速激活系统血液固有免疫反应研究思路的演变与创新

郭峰

1953 年 Nelson 发现人类红细胞可与特异调理过的梅毒螺旋体及肺炎双球菌结合，称为免疫黏附，并推测红细胞膜表面可能存在免疫黏附受体，免疫复合物与该受体结合可促进白细胞的吞噬作用，是宿主防御机制的一部分。后来证明此黏附受体即为 C3b 受体（CR1、CD35）。随后，1981 年Siegel 发现红细胞具有多种免疫功能，不仅可免疫黏附细菌，而且红细胞膜中的过氧化物酶等对细菌还具有氧化杀伤作用，并由此提出红细胞免疫系统的新概念，为补体与补体受体在血液免疫反应中的重要性可量化研究提供了依据。上述研究使人们认识到抗原-抗体免疫复合物能激活补体系统，进而引发补体裂解片段调理致病原与红细胞表面 CR1 黏附，具有向白细胞传递致病原信息以及参与白细胞免疫反应的重要作用，开拓了血液免疫反应中红细胞天然免疫功能与白细胞固有和适应性免疫功能之间网络关系研究的新领域[1]。1982 年，我们在国内首开红细胞天然免疫研究工作，验证了 Siegel等的研究工作的真实性与科学性，我们的研究表明红细胞免疫黏附能力的高低与免疫性疾病（如系统性红斑狼疮）和肿瘤患者的预后转归密切相关[2]。进而在此研究思路上我们还有所创新，创建了免疫原快速激活血细胞固有免疫反应的体外实验研究体系，为现代系统血液免疫学研究提供了扎实的实验研究基础。本文对血液免疫研究思路的演变历程进行回顾，希望对现代系统血液免疫学的创建与开拓能有所帮助。

1 系统血液免疫学创新的源头

Siegel 利用经典途径激活补体系统的原理，设计了人红细胞免疫功能测定的绵羊红细胞花环实验，主要程序是用绵羊红细胞免疫兔从而产生兔抗羊红细胞抗体，滴定效价后，取适量的兔抗羊红细胞抗体进行孵育，加入亚溶血单位的补体，形成抗羊红细胞抗体与羊红细胞和补体相结合的抗原-抗体-补体复合物，将此复合物加至待测人红细胞悬液中，37 ℃ 作用 30 min，形成羊红细胞包绕人红细胞的玫瑰花，以玫瑰花率来判定人红细胞免疫功能的高低。这种通过抗原-抗体复合物激活补体经典途径探讨红细胞免疫功能变化与系统性红斑狼疮等免疫性疾病关系的方法，只能认识到红细胞在清除白细胞免疫反应后产生的免疫复合物方面具有重要作用，却无法证明红细胞对补体调理过的致病原的直接清除作用，对深入研究红细胞固有免疫功能在血液免疫反应中的重要地位具有局限性[3]。酵母菌膜中含有 β-葡萄糖和甘露聚糖，酵母菌可通过旁路和甘露聚糖结合凝集素 MBL 途径激活补体，直接形成抗原-补体复合物，这种被调理而附有补体的致病原可与红细胞表面 C3b 受体（CR1、CD35）相结合。我们用酵母菌取代绵羊红细胞，建立了红心兰瓣的酵母菌花环实验，结果显示致病原进入血液中首先激活了补体系统，被补体调理后的抗原可直接递呈给红细胞处理，证明在白细胞免疫反应产生抗体前，红细胞就可直接参与补体系统对致病原的调理作用[2]；实验还表明细菌可直接通过旁路和MBL 途径激活补体系统和红细胞固有免疫系统，可直接被补体和红细胞识别、灭活和清除，这是系统血液快速固有免疫反应的重要组成部分[4]，致病原不需要通过经典途径激活补体系统即可被清除。酵母多糖直接激活补体系统后能与红细胞表面CD35 分子免疫黏附形成花环，后来我们发现癌细胞膜中也含有多糖，同样可通过旁路和MBL 途径直接激活补体系统，与红细胞和白细胞补体受体免疫黏附形成花环，因此我们建立了肿瘤红细胞花环、肿瘤淋巴细胞花环和肿瘤粒细胞花环，分别作为红细胞固有免疫活性、淋巴细胞固有免疫活性、粒细胞固有免疫活性的强弱指标，用来研究血细胞固有免疫黏附活性与淋巴细胞适应性免疫活性之间的网络关系，具有重要的实用价值。血细胞固有免疫黏附活性高低与 CR1 基因型密切相关，高表达型花环率高，低表达型花环率低[5]，酵母菌花环和肿瘤花环实验的推广与应用对我国红细胞固有免疫功能与其他血细胞固有免疫功能及适应性免疫功能之间网络机制的研究具有重要贡献。但这些实验方法的创立都是还原法的研究思路，需分离出被研究的血细胞，弃除其他血细胞，而不是系统免疫学的研究方法，这些方法用于研究不同血细胞免疫功能之间的网络关系还具有局限性。因此，为了使实验研究方法更客观、更自然和更科学，必须以系统论研究思路改良花环实验。

2 系统血液免疫学方法学新的研究领域的开拓

我们发现肿瘤细胞（包括肝癌细胞、Hela 细胞、小鼠艾氏腹水癌 S180 细胞传代株等）可直接快速激活补体系统，被补体分子调理的肿瘤细胞绝大多数被红细胞免疫黏附，红细胞花环率占总花环数的99%，而白细胞和血小板黏附肿瘤细胞形成的花环率只占 1%。血细胞对肿瘤细胞免疫黏附反应的表现形式只有一种，即血细胞包绕肿瘤细胞形成花环状。酵母菌的体积要小于肿瘤细胞，如果用酵母菌取代肿瘤细胞，酵母菌比红细胞和白细胞小，因此各种血细胞对酵母菌的固有免疫反应可表现出多种形式：①免疫黏附形式，一个红细胞可免疫黏附一个或多个酵母菌；②粒细胞对酵母菌的固有免疫反应可为吞噬或免疫黏附；③淋巴细胞和血小板对酵母菌的固有免疫反应的主要表现形式与红细胞类同，以固有免疫黏附为主[6]。我们将酵母菌加入全血中 37 ℃ 作用 30 min 后，结果显示还是红细胞黏附占多数，粒细胞吞噬以及淋巴细胞、血小板黏附比例均较小，这种发现为以后创立系统血液快速固有免疫反应、红细胞固有（天然）免疫反应主干道假设与理论奠定了实验基础。而将分离法花环实验与系统论花环法相结合，形成自然与分离花环实验免疫研究体系也是一个重大创新。我们用全血肿瘤花环实验和分离法的肿瘤红细胞花环、肿瘤淋巴细胞花环、肿瘤粒细胞花环实验相结合，研究原发性肝癌患者血细胞固有免疫反应变化与正常人之间的差异，结果发现原发性肝癌患者全血细胞肿瘤花环率与分离法的肿瘤红细胞花环率、肿瘤淋巴细胞花环率、肿瘤粒细胞花环率都明显低于正常人，表明原发性肝癌患者系统血液快速固有免疫黏附反应低下，这种变化与血液固有免疫炎症反应的关系值得我们去思考和创新；此外，我们还设计了灭活补体活性的 ETDA 抗凝与不灭活补体活性的枸橼酸抗凝血对比花环实验，发现 EDTA 抗凝血组血细胞包绕黏附肿瘤细胞花环率明显下降，表明补体系统的激活是花环形成的必需条件[7]。不论肿瘤细胞与红细胞补体受体黏附，还是与淋巴细胞补体受体和粒细胞补体受体黏附形成花环，肿瘤细胞都必须首先激活补体系统，肿瘤细胞被补体调理后才能被各种血细胞表面的补体受体捕获，并诱发进一步的免疫炎症反应，这是一种系统的血细胞固有免疫黏附反应。血细胞与肿瘤细胞固有免疫黏附后分子水平的变化规律，需要构建系统论与还原论相结合的系统血液快速固有免疫反应的实验研究体系进行深入研究，而这种灵感与思路，随而构成了现代系统血液快速固有免疫反应的体外实验研究体系。

3 现代系统血液免疫学研究领域的战略性突破

经过对测定红细胞固有免疫黏附能力的花环实验的改良与创新，利用旁路激活补体原理，建立酵母菌红细胞花环、全血细胞肿瘤花环、肿瘤淋巴细胞花环、肿瘤粒细胞花环，我们的研究思路从只研究红细胞的固有免疫功能，过渡到同时还研究其他血细胞的固有免疫功能。这种研究思路的基本点就是考虑到所有血细胞包括红细胞、淋巴细胞、粒细胞、血小板表面都有多种补体受体，可与补体调理过的抗原黏附结合形成花环。在研究实践中，我们会思考一个问题：调理过的致病原（包括酵母菌、肿瘤细胞）被各种血细胞免疫黏附后会发生怎样的后续变化？血细胞膜各种免疫分子的表达会有什么变化？白细胞分泌的各种细胞因子会有什么变化？血浆中补体系统活化后会有什么变化？这就需要设计更客观、更科学而又简单的体外实验免疫研究体系进行验证与进一步的深入研究[8]。我们首先将一定量的枸橼酸抗凝血与一定量的免疫原（如酵母菌或小鼠艾氏腹水癌 S180 细胞株）混匀，37 ℃ 水浴 1 h后离心，结果发现测定的 IL-8 含量与对照组（用生理盐水取代免疫原）相比增加了100 倍以上[9]。表明血细胞不仅可免疫黏附外来的免疫原细胞，而且被外来免疫原物质快速激活后，白细胞可释放细胞因子，并对致病原发生快速的固有免疫炎症反应，这是一种连锁的系统血液固有免疫炎症反应。根据 1 滴血加 1 滴癌细胞混匀37 ℃ 作用 30 min 后，主要表现为红细胞黏附肿瘤细胞形成花环的实验结果[6]，我们需要弄清楚在有红细胞与没有红细胞 2 种状态下，IL-8 等细胞因子的含量变化差异。因此，我们设计了自然与分离实验免疫研究体系：包括自然体系实验组与对照组、分离体系实验组与对照组。自然体系每管均为枸橼酸抗凝全血 0.2 ml 和血浆 0.3 ml，实验组另加免疫原细胞（酵母菌或小鼠艾氏腹水癌 S180 细胞株）0.2 ml，对照组加生理盐水取代免疫原细胞。分离体系每管均为白细胞悬液（用低温冰水法除去红细胞）0.2 ml 和血浆 0.3 ml，实验组与对照组均与自然体系相同，4组混匀后 37 ℃ 水浴 1 h，测定反应液中 IL-8、IL-6 含量。4组都有不同的变化规律，有红细胞的自然体系实验组与对照组的IL-8 与 IL-6 含量都分别低于分离体系实验组与对照组，说明红细胞有负调控 IL-8 和IL-6 的作用；而自然体系实验组和分离体系实验组 IL-8、IL-6 含量都比相应的对照组含量高，说明免疫原可在体外快速激活血液中白细胞分泌细胞因子 IL-8、IL-6 等[8]。自然与分离体系研究结果表明免疫原进入血液中可快速激发系统血液固有免疫炎症反应，而红细胞在系统血液快速固有免疫反应中起着重要的固有免疫炎症反应调控作用。我们可以根据研究目的的不同设计各种公式，计算免疫原的激活指数和红细胞免疫的调控指数，利用这种体外实验免疫研究体系，可发现在系统血液快速固有免疫反应中，补体 C3、C4，红细胞 CD35、CD44、CD55、CD59，白细胞 CD4、CD8、CD25、CXCR4 和白细胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 含量等都有显著变化，表明我们已建立了免疫原快速激活所有血细胞固有免疫活性的现代系统血液快速固有免疫炎症反应的体外实验研究体系，这是一大突破与贡献[10-12]。

4 我国现代系统免疫学的研究基础

国外已有系统免疫学的新概念与新的研究报道。人们已认识到系统免疫学是最新的现代免疫学研究领域，其意指在系统生物学更广阔的范围内，从客观存在的复杂系统工程的角度[13]，对免疫系统的不同子系统与组成之间，各自在免疫原激活系统免疫反应中如何发挥免疫功能，以及对相关的网络调控机制进行公式和数字化的深入研究。但在国际上，系统免疫学的概念还仅仅只是指白细胞免疫系统中各子系统（如 T 细胞子系统与 NK 细胞子系统等）与组分之间的复杂工程的研究[13]。而事实上致病原进入血循环后，首先通过旁路或 MBL 途径被血循环中补体系统等体液性免疫物质所识别激活，进而引发补体系统等体液固有免疫炎症反应。由于 85% 的补体受体 I 型（CR1、CD35）存在于红细胞膜上，致病原被补体分子调理后，85% 黏附有补体 C3b 成分的致病原可被红细胞表面 CD35分子识别、黏附和加工处理，最终递呈给淋巴细胞，通过淋巴细胞 CD2 和补体受体等多种复杂机制，激发淋巴细胞固有免疫和适应性免疫炎症反应；而血小板、粒细胞、淋巴细胞等其他血细胞表面也有补体受体以及 CD55、CD59 分子等，因此还有25% 补体调理后抗原可直接被血小板、白细胞免疫黏附调理，最终引发淋巴细胞的固有免疫和适应性免疫反应。国外已有报道，HIV 进入血液后，首先被补体识别与调理，然后被红细胞表面 C3b 受体（CR1、CD35）免疫黏附处理，将 HIV 分子上 C3b降解为 C3d、C3dg，再递呈给 B 细胞 CR2 处理，最终递呈 CD4+ T 细胞，引发 CD4+ T 细胞免疫反应并导致发病[4]，这说明红细胞固有免疫主干道在系统血液快速固有免疫炎症反应中具有向淋巴细胞传递信息和缓冲致病原损害的重要作用。目前国外还没有体外实验可验证致病原引发系统血液快速固有免疫炎症反应的系统免疫学测定方法，因此我们构建的免疫原快速激活系统血液固有免疫炎症反应的体外实验免疫研究——自然与分离体系也是独一无二的。我们的实验研究体系是系统血液固有免疫反应最简单、最客观的系统免疫学研究方法，是独创的具有中国特色和生命力的方法，是系统免疫学研究战略学方面的突破。将系统免疫学研究范围从白细胞系统扩展到所有血循环系统中血细胞之间网络关系的研究，这是一大创举[14-15]，必将会逐步被学术界所认识，并进一步推广及深化。

总而言之，免疫原快速激活血细胞固有免疫活性体外研究方法从发展时间上可划分为：①分离法的红细胞酵母菌花环（包括红细胞 C3b 受体花环、红细胞免疫复合物花环等）；②分离法的肿瘤红细胞花环、肿瘤淋巴细胞花环、肿瘤粒细胞花环；③自然法的全血细胞花环；④系统免疫学自然与分离体系。最近形成的现代系统免疫学自然与分离体系方法，根据研究目的的不同可选择不同的设计和计算公式，这些方法学的具体设计还有很大的研究空间，值得我们深入探讨[15]。本文回顾了系统血液固有免疫反应研究思路与方法创新及演变的历程，希望对读者了解系统血液免疫学的形成与创建能有所帮助。

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