组织工程化皮肤低温保存的研究进展

陈凡凡 崔磊 曹谊林

组织工程化皮肤，是指有机体分离出来的表皮细胞或成纤维细胞在一种三维生长支架上进行体外复合培养，形成再生的表皮或真皮等同物。组织工程化皮肤作为一种皮肤创伤修复材料和损伤皮肤的替代品，不仅被覆在创伤表面、保护创面、促进皮肤的恢复和生长，而且支架材料中的活性细胞还能通过分泌生长因子促进细胞增殖、诱导细胞分化，使组织工程化皮肤最终能永久地代替损伤和（或）缺失的皮肤。为了缩短临床上各种急慢性皮肤缺损患者等待体外构建组织工程化皮肤所需的时间，及时提供可供移植的替代“皮肤”，必须解决组织工程化皮肤的保存问题，这也直接关系到其商业化应用的前景。目前，国内外均在进行组织工程化皮肤的低温保存和临床应用研究，其关键是保存其中的细胞活性与功能、细胞与支架材料特异性粘附及支架材料的生物力学性能。贺旭等[1]对复方壳多糖组织工程化皮肤4℃保存的实验发现,组织工程皮肤冻存7 d后，表皮活力值为未冻存时的62.46%，真皮活力值为未冻存时的54.21%。据报道，用含10%二甲亚砜、10%胎牛血清的抗冻剂-75℃保存,可保存6个月[2]。如果在-196℃的环境下，细胞、生物组织处于所谓“生命悬持状态”，新陈代谢几乎停止，在理论上几乎可以无限期储存[3]。因此，低温冷冻保存是活体组织长期保存的一种有效方法，有望长期有效地保存组织工程化皮肤产品，建立组织工程化皮肤库，以随时提供临床移植用的产品。

1 低温冻存的概述

1.1 冰冻损伤两因素假说

冻伤是低温保护最大的负反应，组织与细胞冻伤的防治是低温冷冻保存成功的关键。1972年，Mazur[4]提出冷冻损伤的两因素假说，认为造成冷冻损伤有两个独立的因素：一是胞内冰的形成（Intracellular ice damage），是过快冷却导致的，冷却速度越快损伤越大；另一是“溶质损伤”（Solute damage），或称“溶液损伤”（Solution damage），是因冷却过慢而产生的，是由于细胞在高浓度的溶液中暴露时间过长，冷却速度越慢损伤越大。快冷却是传热起主要作用的过程，水分来不及渗出胞外，大量胞内冰形成。慢冷却是质量迁移起主要作用的过程，水分由胞内大量渗出，细胞剧烈收缩，但无胞内冰产生。由于此两因素的综合作用，理论上就必然存在某一最佳冷却速率，并对应于低温保存的最佳存活率。

1.2 冷冻保护剂（Cryoprotective agent，CPA）

在不加冷冻保护剂而直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白变性等，引起细胞死亡。所以，细胞和生物体的低温保存离不开冷冻保护剂。冷冻保护剂又称抗冻剂，合理地选择冷冻保护剂对低温保存至关重要。冷冻保护剂应具有以下特点：易溶于水，对细胞无毒，易从组织细胞中清除。其作用主要表现在增加膜通透性，加速细胞内的水分流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。

冷冻保护剂大致分为两类。一为渗透性冷冻保护剂，多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而弱化水的结晶过程，达到保护目的。常用的渗透型冷冻保护剂有甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但渗透型冷冻保护剂使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同，如甘油适宜于慢速冷却，而DMSO却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性。二是非渗透型冷冻保护剂，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。非渗透型冷冻保护剂主要有聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingyl pyrollidone，PVP）、蔗糖（Sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，Dextrane）、聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、白蛋白（Albumin）、羟乙基淀粉（Hydroxethyl starch， HES）等。此类冷冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。

冷冻保护剂虽有保护作用，但也有一定的毒性。其毒性作用机制可能是：①通过细胞膜引起的渗透性损伤（物理性损伤）；②与蛋白质和（或）脂膜结合，使之变性（化学性损伤）。这些损伤与温度、防冻剂的含量有关。一般是温度越低时，冷冻保护剂毒性越小；冷冻保护剂含量越高，毒性越大。因此，保护剂的种类、浓度及加入、清除的方式对细胞的存活都有一定的影响。

2 组织工程皮肤的低温保存

组织工程产品深低温保存中使用冷冻保护剂的目的是通过替换细胞和组织内的水分，将降温-冻存-复温循环中冰晶形成引起的损害减到最小，并促进细胞非结晶态的生成。组织工程化皮肤根据解剖和发挥的主要替代作用可以分为表皮替代物、真皮替代物和复合皮肤替代物。目前的低温保存研究的热点，主要集中在真皮替代物和复合皮肤替代物的保存。

2.1 真皮替代物的低温保存

Teasdale等[5]研究了低温保护剂种类以及降温速率对以胶原凝胶为支架的组织工程化真皮活性的影响，结果表明，以DMSO为低温保护剂，以较低的速率降温可取得较好的保存效果。Applegate等[6]就组织工程化真皮低温保存过程中存在的问题进行了综述，指出细胞损伤是影响真皮替代物低温保存效果的主要因素之一，且体外培养的细胞更易于形成胞内冰，而支架材料、细胞及细胞外基质热膨胀系数的差异可能会形成导致组织及细胞损伤的热弹性应力。王欣等[7－8]对以聚羟基乙酸（PGA）纤维（编织）为支架的组织工程化真皮，用DMSO为低温保护剂进行了程序降温的低温保存实验，探讨低温保护剂的浓度、降温速率等对组织工程化真皮低温保存效果的影响。实验显示，培养14 d的组织工程化真皮置于10%DMSO溶液中，以1℃／min速率降温至-196℃可获得75%的细胞存活率，可满足临床应用的要求。

2.2 复层组织工程化皮肤的低温保存

Harriger等[9]采用培养的人角质细胞和成纤维细胞制成的组织工程皮肤，以10%DMSO为防冻剂，进行20℃/min的程序性降温，至-196℃保存，然后置于37℃水浴中快速复温，发现组织工程化皮肤活力欠佳，认为可能与防冻剂的含量有关。Kentaro等[10]将成纤维细胞扩增后种植于皮肤支架上，支架由单层的海绵状透明质酸和胶原构成，冻存保护剂为DMEM+10%DMSO+40%胎牛血清。结果显示，在-152℃保存3周,复苏后最高的即刻细胞存活率为56.2%，经过37℃水浴快速复苏并再培养1周后，细胞数量扩增到冻存前的200%。后续研究显示，在-152℃保存1年后，细胞存活率为52%；保存2年将降至29.5%；经-80℃保存6个月，或-152℃保存1年，都能保持足够的细胞活力和增殖活性，并表达足够的成纤维细胞生长因子[11]。鲁元刚等[12]研究了复方壳多糖人工皮肤的冻存，他们将培养1周的人工皮肤置于含90%基础培养基 ＋10%DMSO的冻存液中，按4℃30min、0℃过夜、-20 ℃ 2～3 h、液氮气相 6～8 h、液氮液相的冻存，复苏后培养1 h，可见真皮基质内的成纤维细胞又伸出突起，开始生长，但在细胞外基质中发现有较大的孔隙，且大小不均匀；继续培养1周后，胞外基质孔隙基本消失，表皮可大致区分为基底层、棘层和角质层，各层均有层数不等的扁平梭形细胞，外周的表皮细胞结合不甚牢固，易脱离。人工皮肤的真皮部分，可见呈梭形结构的成纤维细胞大致平行排列，分布有序。所有复苏的标本都恢复了正常的代谢活动，角质形成细胞与成纤维细胞的生长特性与未进行冻存的人工皮肤基本相同。

2.3 玻璃化低温保存方法

从目前的研究成果看，传统的低温保存技术对仅含成纤维细胞的真皮替代物保存效果较佳，能满足临床应用的要求，而对双层组织工程化皮肤的保存效果并不理想，因其对表皮细胞的损害较大。因此，玻璃化保存可能是组织工程化皮肤产品更理想的保存方法。玻璃化（Vitrification）是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。溶液在冷冻过程中黏稠度增高，相变后转变成固态时，不形成或只形成对细胞结构无损伤的极小冰晶，高黏性使分子的弥散受到极度抑制，液体固化为玻璃态，从而避免冰晶形成过程中对细胞的损伤。使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。玻璃化低温保存方法，是将生物组织或细胞经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。保存终止后，复温要快速化冻，防止去玻璃化的发生。生物组织或细胞能安全渡过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。但是，高浓度的冷冻保护剂对生物组织或细胞具有潜在的毒性反应，而且这种毒性反应与冷冻保护剂浓度和温度密切相关。因此，用玻璃化法冻存组织细胞[13－15]的关键是在可形成玻璃化状态的前提下，尽可能选择较低的冷冻保护剂浓度，以减小冷冻保护剂的毒性反应，并仔细控制好整个玻璃化保存过程的操作环节，达到保存组织细胞结构和功能的目的。玻璃化保存液已可成功保存如胰腺[16]、组织工程化骨[17]、干细胞[18]、皮肤和表皮细胞[19－22]、血管[23]、气管[24]等。 Pasch 等[19]把角质细胞种植于小培养皿形成细胞单层，比较了100 g/L丙三醇、100 g/L乙二醇、100 g/L DMSO和10%的羟乙基淀粉（HES）对单层角质细胞的保存效果。结果发现，复温后细胞层在光镜下完整无裂隙，HES以3℃/min速率降温得到了28.5%的细胞回收率，明显优于1℃/min的降温速率，也优于DMSO等其他3种保存剂。其后续研究提示，单层细胞冻存的回收率要高于悬浮细胞冻存组[20]。程启康等[21]用包含5.4 mol/L乙二醇和1.4 mol/L DMSO的玻璃化液冻存成纤维细胞获得了87.1%的细胞存活率。组织工程化皮肤产品的玻璃化溶液配方、达到玻璃化的深低温过程、损伤机制、复温条件等研究尚处于起步阶段，还需深入研究，其有效性亟待验证。

2.4 海藻糖在玻璃化冻存中应用

玻璃化法缩短了冷冻处理的时间，简化了步骤，不需要昂贵的设备，不要求严格的降温速率，但最不利的因素就是高含量的防冻剂的毒性作用。所以，降低玻璃化保存液中透入性抗冻剂的含量，或完全由糖类、聚合物替代，以降低其毒性和解冻时对细胞的渗透性破坏是目前的主要研究方向。在非渗透性保护剂中，海藻糖是目前研究的热点。它是由2个葡萄糖分子以α,α,1,1,-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下，在细胞表面形成特殊的保护膜，有效保护生物分子结构不被破坏。它的抗冻机制[25－29]是多方面的：①在冷冻之前使细胞脱水，减少细胞内的含水量，并在生物分子表面依靠带电荷的水合基团间的氢键形成保护膜，代替了维护三级结构所必需的水分子，从而使组织在极低水分时仍保持细胞膜结构功能的完整性，避免细胞内成分的损失；②有助于避免渗透性保护剂渗入细胞所导致的过度膨胀和渗透性休克；③能代替脂质分子头部基团间的水分子，降低膜的相变温度，防止重新水化时脂质状态的转换及伴随出现的裂缝；④能非特异性地稳定细胞内生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子结构；⑤具有极佳的玻璃化特性，其玻璃化温度接近-30℃，比传统渗透性保护剂的玻璃化温度（<-65℃）要高得多。海藻糖已被应用于胚胎干细胞[30]、精子[31]、红细胞[32]、皮肤[33]等。 Erdag 等[33-34]发现，应用海藻糖/DMSO作为保护剂，能提高冻存的胎儿皮肤的活力。将该方法所冻存的皮肤移植到免疫缺陷大鼠后，移植面与新鲜未冷冻皮肤移植组无明显差别，并且显著的优于传统保护剂组。

3 展望

目前，组织工程化皮肤仅限于个性化、小规模的应用，停留在临床研究和实验室水平。要真正形成产业，必须解决组织工程化皮肤的保存问题，建立标准化的保存方法。因此，冻存技术将在组织工程化皮肤的研究与开发应用中发挥重要作用，相信随着组织工程化皮肤玻璃化冻存研究的不断深入，组织工程化皮肤的产业化、商品化将获得实现，成为临床治疗皮肤损伤和缺损的首选方法。

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