腰椎间盘退变研究的方法学选择与评价（二）

廖鹰扬，刘少喻，邹学农

随着研究的逐步深入，腰椎间盘退变的基础和临床工作不断取得进展，有关退变机理与病理变化的研究成果不断涌现，学者们日益重视相关研究方法、评估指标在退变中的作用和意义。

4 动物实验研究中的方法学选择与评价

4.1 实验动物模型

椎间盘退变实验动物模型的建立是研究椎间盘退变性疾病的一种重要手段，同时也为椎间盘退变的再生修复研究提供了良好的实验载体。动物模型应具有以下特点：（1）能较好地重现椎间盘退变病理改变的客观发展规律；（2）模型较易制备，可重复性好，否则将影响可比性；（3）实验动物的生理和解剖特点应尽可能与人类接近；（4）实验动物的经济性。椎间盘退变动物模型的制备已有超过70年的历史，早期Lob等[1]在损伤兔椎间盘后观察到与人类椎间盘退变相似的病理改变，此后鼠、兔等小型动物被先后用于制模[2]。由于考虑到制模手术的可行性、可重复性以及对人类疾病的高模拟性，近年来多采用猪、狗、羊等大型动物制模[3]。如不考虑价格因素，恒河猴等灵长类动物是用于制作椎间盘退变模型的最理想动物[4]。

在椎间盘退变的研究中，生物力学方法除了可用来模拟各种机械载荷环境以制作椎间盘退变模型外，还可用于评价椎间盘退变过程中的生物力学特性。椎间盘退变的危险因素除年龄、遗传易感性外，生物力学因素自始至终贯穿在椎间盘的退变过程中，是病变发生发展的关键因素。因此，研究椎间盘局部组织的生物力学特性及其与纤维结构、蛋白多糖含量之间的关系，并以此为基础提出早期诊断、指导治疗策略是至关重要的[5]。

4.1.1 持续应力型动物模型 此类模型并不直接破坏椎间盘结构，而是通过外力或改变脊柱载荷使应力重新分配并在局部产生生物力学效应，以此来达到诱发椎间盘退变的目的。

4.1.1.1 双后肢动物及折尾法椎间盘退变模型Cassidy等[6]切除出生后SD大鼠的双前肢与尾部，成活幼鼠在饲养过程中仅依靠双后肢直立行走，使下肢负重增加进而诱导了实验动物椎间盘退变的发生。Lindblom等[7]将大鼠尾部折弯成“U”形，持续观察一段时间后发现鼠尾椎间盘受压侧纤维环发生了退变。

4.1.1.2 制动型椎间盘退变模型 早期有学者采用石膏固定、椎体内固定和椎体融合等方法，使椎间盘处于一种失用状态，进而诱导椎间盘髓核与纤维环产生废用性萎缩[8,9]。但在这种制模方法诱导下，细胞以萎缩、凋亡为主，坏死、炎症反应并不明显，因此不能较好地模拟人类的椎间盘退变。

4.1.1.3 脊柱不稳型椎间盘退变模型 此类动物模型是运用外科手段破坏小关节或韧带等结构造成脊柱不稳，使动物在生理负重的环境下逐渐发生椎间盘退变，具有更接近于临床病变且耗时较短的优点。Miyamoto等[10]最先通过咬除棘突和剥离椎旁肌的方法构建小鼠脊柱失稳模型，术后6个月可见软骨组织增生、纤维环破裂、髓核皱缩等改变。Wang等[11]采用改良方法切除了小鼠颈椎椎旁肌肉与后柱韧带，术后3个月即可见椎间盘的组织学与分子生物学病理改变，出现明显的髓核细胞凋亡与炎症反应。

4.1.1.4 循环性外力（cycling stress）型椎间盘退变模型 Iatridis等[12]的动物模型研究表明，短期动态加压可刺激椎间盘基质的产生，而单纯制动则抑制基质合成代谢。Wuertz等[13]研究发现，在频率、强度分别为0.2 Hz、0.2 MPa的水平上进行动态加压生物力学实验时，椎间盘基质合成的mRNA转录水平可获得稳定维持。而频率、强度高于或低于此节点的动态加压则会导致mRNA表达的不同改变，分别对应椎间盘的重构、修复或退变。当椎间盘被施加外力的时候，外力的大小、频率与作用时间在一定范围内具有维持椎间盘生理机能的作用，但超过生理可承受范围则会导致退变的发生，这就是循环性外力型椎间盘退变模型的制作原理。相对于前几种间接应力制模方法，循环应力制模精确可控，重复性好，有利于分析应力与退变量化指标之间的线性关系，近年来其应用越来越广泛。

4.1.2 直接损伤型动物模型

4.1.2.1 机械损伤型动物模型 此类制模是通过手术方法损伤椎间盘结构而诱导退变的发生。主要包括以下几种方法：（1）髓核损伤法：通过穿刺等手段损伤髓核，破坏其完整的生物力学结构，创伤较小。（2）纤维环损伤法：按损伤部位可分为前正中、前外侧、后正中及后外侧损伤；根据损伤方式可分为切割、纤维环开窗术、针刺及刮擦等。（3）软骨终板损伤法：主要是经椎体钻一个斜行孔道以损伤软骨终板，此法创伤较大，且损伤后立即出现一些继发性病变如Schmorl’s结节、局部血肿及炎症反应等，对实验结果的观察造成干扰。总的来看，手术机械损伤制模创伤较大，且难以重复，目前已逐渐被淘汰。微创技术可以减轻因损伤椎间盘以外结构所造成的对实验结果的误判，同时降低了实验动物的死亡率，但这类制模方法始终难以避免因非直视下操作难以掌控损伤程度、不同术者之间结果差异较大而影响实验的可重复性与可比性，且对实验条件要求较高的缺点。

4.1.2.2 化学损伤型动物模型 通过椎间盘髓核内注射木瓜蛋白凝酶[4]及纤维蛋白结合片段[14]等化学损伤方法来溶解髓核并诱导炎症的发生。此类制模方法可操作性强，重复性好，实验周期短，但化学物质导致退变的作用机制与人类椎间盘退变的病理改变仍有较大差异，此外，化学物质的残留可能对生物化学评价结果造成影响。

4.1.3 营养代谢紊乱型动物模型 运用糖尿病动物模型[15]或选取自然高渗饮食习惯所致自发性椎间盘退变的沙鼠[16]来制作椎间盘退变模型，能够在一定程度上模拟人类代谢性因素引起椎间盘退变的病理过程，而且在一定程度上减少了人为因素的影响，可操作性和可重复性均较好，但研究周期较长，且受实验动物来源的限制。

4.1.4 基因型动物模型 随着分子生物学与基因工程技术的发展，通过转基因技术制备椎间盘退变模型成为一种新的制模途径。Sahlman等[17]以基因沉默技术使到小鼠椎间盘Col2a1基因失活，尽管在一段时间后基因活性恢复，但足以造成不可逆转的椎间盘退变，椎间盘组织内相继出现蛋白多糖表达减少、纤维环纤维化及终板骨化等病变。此类模型可重复性好，可操作性强，有着较为诱人的应用前景。

4.1.5 体外组织/细胞模型 椎间盘退变的研究对象主要是动物模型或通过手术取材的患者病变椎间盘，然而在特定研究中，尤其是需要以健康完整的椎间盘组织作为研究对象但受医学伦理学限制或技术条件影响难以实现，或必须在特定的体外环境进行实验时，需要涉及体外组织或细胞模型。Korecki等[18]构建了牛尾椎间盘体外实验体系，该体系在体外8 h内可较好地维持组织糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）含量及细胞代谢活性，适用于需要对同一椎间盘进行生物力学与分子生物学评价的研究。Gantenbein等[19]通过维持终板渗透稳定性的方法，使离体7 d内羊椎间盘组织中的GAG合成与细胞活性保持不变。

4.2 主要评估指标与观察方法

椎间盘生物力学特性的评价指标主要包括基质内压/应力（internal pressures and stresses）[20,21]以及与之密切相关的一系列生物力学参数：椎间盘高度（height of intervertebral discs）[20,21]、弹性模量（elastic moduli）[22,23]、极限抗张/压强度（damage strain/stress）[22,23]、硬度（stiffness）[10,24]和纤维方向角（fiber orientation angle，即纤维环纤维方向与水平面之间的夹角）[22]等。其中最重要的观察指标是组织（基质）内压/应力（基质内压表现在健康的椎间盘，为液态压力传导特征，可以把上位椎体的压力均匀传导至下位椎体；应力表现在退变的椎间盘，为固态力学传导特征，应力不均匀和应力集中可使基质结构发生破坏[21]），主要是因为：（1）椎间盘细胞代谢对其生物力学内环境的变化非常敏感，而基质内压/应力代表了基质生物力学内环境的主要特征；（2）基质内应力集中或应力斜率升高会增加潜在基质结构破坏的机会[25]，而其他观察指标则是对基质内压/应力改变的侧面评价与补充，或仅为对其继发性改变的评价。例如，水分丢失可导致髓核内压力减少，髓核弹性模量降低，进而导致椎间盘高度减少；而应力集中在纤维环可导致纤维环纤维化，纤维网络交联增多，从而引起纤维环弹性模量和硬度的增加[21,25]。

目前学者们主要通过下列研究手段获得各种生物力学评价参数：（1）电动拉力/压力测试机，用于测量极限抗拉强度、最大应变及弹性模量等生物力学数据，绘制拉（压）力-应变曲线[22,24]；（2）在数学模型基础上建立标准化方程，用以测量纤维方向角[22]；（3）有限元模型（finite element module，FEM），通过计算机软件模拟运动节段（motive segment，包括椎间盘与相邻两个椎体）的材料力学与生物力学特性，广泛应用于各种生物力学参数的评价并由此设计组织工程基质[25]；（4）组织诊断传感器（tissue diagnostic instrument，TDI），由骨诊断仪器改进而成[26]，用以在2 mm旋转分辨度下测量组织力学性能。这种装置的工作原理是通过分析组织的局部弹性与黏性组分而达到提供量化参数的目的，能够敏感地探测到椎间盘组织中黏弹性的改变，进而了解基质力学特性的概况。

4.3 椎间盘基质内压/应力等评价参数在椎间盘退变发病机理研究中的应用

4.3.1 生理条件下椎间盘赖以维持生物力学稳定的结构特征 健康青年人椎间盘中的应力主要表现为单纯的液体压力，由髓核首先承受载荷，然后均匀传递到纤维环与下位终板。因此整个椎间盘的功能如同一个“水床床垫”，均匀地向邻近椎体传递载荷[27]。纤维环各层纤维之间是根据不同的力学载荷方向互相有规律地交织（类似长干骨的骨小梁），且纤维环各层的弹性模量与极限抗张（压）强度从内到外单向递增，而在纤维环同一层中，纤维方向角从前到后逐渐单向递增（从最前方部分25°～30°到最后方部分70°～90°，几乎与后纵韧带平行），因此纤维环在经受压力或扭转、屈伸等剪切力时可以有效地保持结构稳定，难以撕裂[22]。然而，在衰老、退变、机械载荷、姿势改变、外伤等致病因素介入作用下，椎间盘有可能会出现病理变化的发生与发展[21,25]。

4.3.2 椎间盘潜在的生物力学薄弱点 Adams等学者[21,25]认为，髓核在各种致病因素的影响下，首先出现水分减少、髓核内压降低，生物力学内环境的改变使GAG合成降低，而GAG含量的降低又进一步加剧了髓核内压的下降，整个过程是一个恶性循环的正反馈效应，这说明椎间盘缺乏对轻度损伤、内环境紊乱的自身调节机能，除非中途出现治疗干预，否则椎间盘的退变、结构破坏的病理发展过程将愈演愈烈。Zhu等[22]的研究显示，人类椎间盘纤维环的正后方及其附近纤维的弹性模量最低，而其纤维方向角达到70°～90°，几乎与后纵韧带平行。这削弱了对向后方的剪切应力集中的抵抗能力，使这部分纤维环易于破裂，这可能是临床上该部位频繁发生椎间盘膨出、突出的主要原因。

4.3.3 衰老与退变对椎间盘基质生物力学内环境的作用 Wagner等[24]研究表明，随着增龄引起的纤维环水分减少以及胶原的交联作用，尽管纤维环的硬度和弹性模量在增加，但也无法完全代偿这种形变，即无论患者年龄大小，退变椎间盘总是表现为显著的生物力学改变和体积的缩小。随着髓核明显收缩，巨大的应力通常会首先集中在纤维环，然后才到髓核。而单纯的椎间盘老化过程中，椎间盘功能并不会随着年龄的增长而加速退变，90岁以上老年人椎间盘的生物力学特性与中年人相比并无显著差别。

4.3.4 机械载荷对椎间盘基质生物力学内环境的作用 机械载荷使软骨组织因丢失水分而导致体积缩小。McMillan、Botsford等[27,28]发现尸体椎间盘高度在6 h、1500 N负荷后丢失18%，而人类在日常生活中每天都会丢失约18%的椎间盘高度，但丢失的高度在夜间休息后得到恢复。椎间盘在经受机械负荷之后，首先是髓核丢失水分，然后是髓核内压力降低13%～36%，之后与衰老退变的椎间盘一样会发生“漏气轮胎样”改变。但与衰老不同的是机械载荷诱导的椎间盘水分减少和高度丢失可在夜间得到恢复。

4.3.5 身体姿势对椎间盘基质生物力学内环境的作用 Adams等[20,21]的研究证实，当同属一个脊柱运动单位的2个相邻椎体在处于相对屈曲或伸展位下经受机械载荷，其椎间盘内压（应）力会产生剧烈变化。对于大部分中年人椎间盘来说，在屈曲位与伸展位经受载荷后会对纤维环的前部和后部分别产生巨大的应力。负重力线上细微的改变即可导致纤维环上巨大的应力变化，例如，在中立位基础上脊柱伸展增加2°即会形成显著的应力集中，作用在后纤维环上的应力约增加30%。

4.3.6 外伤对椎间盘基质生物力学内环境的作用外伤常会导致基质内压（应）力紊乱，Adams等[20,21]指出，椎间盘在经受外伤后，髓核内压平均减少25%，而在50～70岁老年人的椎间盘中，髓核内压可降低80%，其主要原因是老年人椎间盘通过形变而使应力均匀分散的能力的减弱和衰退。通常椎体终板的轻微损伤难以在X线侧位片上观察到，但却会导致终板向椎体膨出，纤维环向外膨胀，造成应力紊乱、结构受损的恶性循环。虽然可以容纳髓核的体积仅轻微增大，但在压力-体积曲线上突破临界点后，容积每增加哪怕轻微的一点都会导致压力的急剧下降。Przybyla等[29]的随机对照实验亦表明，与外层纤维环损伤相比，终板损伤更易导致椎间盘压（应）力传导紊乱，因为其将直接引起髓核向椎体内膨出，容积增加，髓核内压急剧减少。

上述衰老与退变、机械载荷、姿势变化和外伤等多种影响因素，都会使髓核内水分与蛋白多糖减少，髓核内压降低，发生“漏气轮胎样”改变，此外，髓核承重能力的下降会导致应力集中在纤维环，导致纤维环破裂的机会增大，作为代偿，大量纤维组织交联，非纤维组织出现纤维化，同时反复损伤也会导致炎症的介入[21]。而髓核内压下降将会导致蛋白多糖含量的减少，随后引起髓核内压的进一步降低，形成恶性循环，究其原因主要是髓核细胞对局部生物力学环境异常变化所引起的反应，导致椎间盘细胞代谢异常[21]，继而使基质降解酶在压（应）力异常的区域合成增加，导致基质结构的降解、破坏[30]。而 Pollintine、Luo[31,32]等发现，退变的椎间盘受压产生形变，使前柱的抗载荷能力减低，最终将应力传递到椎弓根和小关节，引发继发性增生、椎管狭窄等病变。

5 临床研究中的方法学选择与评价

目前临床上用来评价与椎间盘退变相关的下腰痛、继发性病变疼痛程度与功能分级的评分标准主要有JOA评分（Japanese Orthopaedic Association scores）、Oswestry功能障碍指数（Oswestry disability index，ODI）[33]、Prolo评分[34]、视觉模拟评分（visual analogue scale，VAS）[35]、MacNab标准[36]、Eismont[37]评分、Charles疗效评定以及国内的北医三院标准[38]等。VAS是一种专门用于调查患者疼痛主观感受程度的评分，比较灵敏细致，可以对治疗前后患者的疼痛程度进行比较，但受主观因素影响较大；JOA评分不但能反映主观症状，也能评价客观体征的变化，但是不能象VAS那样将疼痛程度进行量化，而仅仅是按疼痛发生的频次与程度粗略地分为4个级别；Oswestry功能障碍指数强调对患者参与生活和社会活动能力的直接评价，由于不同患者其耐受与适应能力不同，因此疼痛和功能障碍程度与参与生活和社会活动能力亦即生活质量的高低未必平行，因此，Oswestry功能障碍指数比起JOA评分、VAS等更加适用于衡量患者的社会适从性。MacNab分级标准与Prolo评分专门用于评价手术前后症状与功能的改善程度，是指导下一步治疗以及判断是否需要再次手术的参考标准之一；Eismont评分则是专门用来比较手术治疗前后下肢肌力的评价系统。

6 问题与热点

目前在椎间盘退变发病机理和临床应用的评价方法学领域需要迫切解决的问题与研究热点主要包括以下几个方面：（1）生物力学测量仪器与测量方法的改进：许多学者仍然对椎间盘生物力学测量方法的可靠性、可行性、科学性及可重复性心存疑惑，需要进一步的实验研究去发现问题，解决问题并提出改进思路。在严重退变的椎间盘中，椎间盘高度丢失，体积压缩，在不损坏设备的前提下插入传感器是非常困难的，因此传感器易于损坏，可能导出错误的数据；此外，传感器的分辨度受限于2 mm之内，只能测试压力而不能检测拉力和剪切力，因此认为目前采取的评价方法仅限于分析椎体宏观运动、纤维环膨胀以及与基质内压/应力有关的改变，而其他参数如整体应力（entire stress）、应变区域（strain fields）则难以测量，因此改进仪器及设计合适的数学模型成为更好地评估椎间盘细胞基质生物力学特性如纤维环分层结构、胶原纤维网络以及其受到剪切应力集中下损伤的具体过程等的研究要素。（2）对发病机理、细胞生物学及生物力学特性的加深认识和扩展应用：目前对椎间盘基质特性与功能的研究仅仅是初步的，需要更多实验研究去加深理解，明确化学构成改变及终板的病理改变在基质内细胞生物学及生物力学紊乱的发生发展中所起的作用，阐释影像学、临床表现、宏观组织病理学变化、微观分子生物学及生物力学特性等评价参数之间的内在联系，以及这些联系在椎间盘退变发病机理和临床诊断治疗中所代表的意义。（3）考虑到椎间盘与四肢关节软骨细胞化学、生物力学特性的相似性，椎间盘退变的生物力学模型、分子生物学、磁共振等评价的方法学、相关特性与理念是否能类推到关节软骨、半月板的研究（反之亦然），是一个值得深思的问题。如果这一思路是可行的，那么就可以使两个领域的研究互相促进，互相借鉴，共同发展。（4）把基因表型的改变与椎间盘基质细胞在生物力学内环境中的变化联系起来。例如，椎间盘退变过程中胶原合成从Ⅱ型胶原的表达转换到Ⅰ型胶原的表达，反映了一种由水分丢失或结构破坏引起的椎间盘基质材料特性从液态样向固态样转变的过程。在年青健康的椎间盘基质中并无血管与神经，高液体压力可阻止任何空心管道如血管在其内的生长，而退变椎间盘基质内这种液态样特性的丢失，证实了椎间盘源性腰痛病人的血管与神经在椎间盘内的异常生长。如此可望在未来通过将仿生髓核注射于椎间盘内使基质内压力发生改变的方法来阻止血管、神经的长入，从而起到治疗椎间盘源性腰痛的作用。（5）与椎间盘退变发展和下腰痛形成有重大关系的一些标记物或细胞因子：TNF-α、基质金属蛋白酶，VIP、CGRP等多肽，椎间盘纤维环外层痛觉纤维等。（6）自然衰老与程序化死亡之间的关系及其在椎间盘退变过程中的意义：程序性细胞死亡在椎间盘退变与衰老过程中扮演着重要角色，因此可能成为未来的治疗方向之一。（7）进一步开发新的MRI成像序列、参数、技术、回波时间以及新型MRI增强造影剂（如叶酸造影剂等），探索MRI成像与CT椎间盘造影诱发痛之间的关系、椎间盘后部高密度带以及Modic改变等。（8）在临床研究中，诸多诊断性实验评估方法（主要是影像学方法）如何能够最大限度地提高灵敏度和特异性，降低假阳性率与假阴性率，使之尽量与临床症状、宏观与微观的病理变化相契合，从而达到明确诊断、引导治疗干预措施的最优化选择是未来的一个重要发展方向。（9）降低临床诊断性评价方法的成本，提高应用的便利性，减少对病人的侵入性创伤，避免放射暴露等危害，增加社会适从性，以增大应用范围，使更多的患者受益于医学科学技术的发展。

7 小结

椎间盘退变研究的方法学始终围绕着一条主线，即阐述退变发病机理，厘清退变病理变化的具体发展路径。一些方法如组织学观察、X线平片检查等已经应用了几十年，但至今仍可在提出新的评分方法、分类分期标准等方面发挥潜力。得益于分子生物学、生物力学、生物化学及影像物理学等相关学科的迅猛发展，通过免疫组化、PCR、MRI、计算机生物力学模型及力学传感器等技术可以不断发现并比较细胞水平、亚细胞水平的不同化学成分和重要功能分子含量的变化及其基因表达水平的改变，研究者们希望以此来阐明椎间盘退变的发病机理与具体病理发展过程，并服务于临床，同时不断创新、修正诊断方法与治疗干预手段，最终达到减缓甚至解决全世界范围内椎间盘退变病患痛苦的目的。

1 Lob A,Holm C.Die zusammenhange zwischenden verletzungen der bandscheiben and der spondylosis deformans im tierversuch[J].Dtsch Ztschr Chir,1933,240:421-440.

2 Berry RJ.Genetically controlled degeneration of the nucleus pulposus in the mouse[J].J Bone Joint Surg Br,1961,43:387-393.

3 Hansen HJ.A pathologic-anatomical study on disc degeneration in dogs[J].Acta Orthop Scand,1951,20(4):280-293.

4 Lotz JC.Animal models of intervertebral disc degeneration:lessons learned[J].Spine,2004,29(23):2742-2750.

5 Schultz DS,Rodriguez AG,Hansma PK,et al.Mechanical profiling of intervertebral discs[J].J Biomech,2009,42(8):1154-1157.

6 Cassidy JD,Yong-Hing K,Kirkaldy-Willis WH,et al.A study ofthe effectsofbipedism and uprightposture on the lumbosacral spine and paravertebral muscles of the Wistar rat[J].Spine,1988,13(3):301-308.

7 Lindblom K.Intervertebral-disc degeneration considered as a pressure atrophy[J].J Bone Joint Surg Am,1957,39-A(4):933-945.

8 Schendel MJ,Dekutoski MB,Ogilvie JW,et al.Kinematics of the canine lumbar intervertebral joint.An in vivo study before and after adjacent instrumentation[J].Spine,1995,20(23):2555-2564.

9 Cole TC,Burkhardt D,Ghosh P,et al.Effects of spinal fusion on the proteoglycans of the canine intervertebral disc[J].J Orthop Res,1985,3(3):277-291.

10 Miyamoto S,Yonenobu K,Ono K.Experimental cervical spondylosis in the mouse[J].Spine,1991,16(10S):S495-S500.

11 Wang YJ,Shi Q,Lu WW,et al.Cervical intervertebral disc degeneration induced by unbalanced dynamic and static forces:a novel in vivo rat model[J].Spine,2006,31(14):1532-1538.

12 Iatridis JC,MacLean JJ,Roughley PJ,et al.Effects of mechanical loading on intervertebral disc metabolism in vivo[J].J Bone Joint Surg Am,2006,88(S2):41-46.

13 Wuertz K,Godburn K,MacLean JJ,et al.In vivo remodeling of intervertebral discs in response to short-and long-term dynamic compression[J].J Ortho Res,2009,27(9):1235-1242.14 Cinotti G,Della-Rocca C,Romeo S,et al.Degenerationchanges of porcine intervertebral disc induced by vertebral endplate injures[J].Spine,2005,30(2):174-180.

15 Won HY,Park JB,Park EY,et al.Effect of hyperglycemia on apoptosis of notochordal cells and intervertebral disc degeneration in diabetic rats[J].J Neurosurg Spine,2009,11(6):741-748.

16 Gruber HE,Johnson T,Norton HJ,et al.The sand rat model for disc degeneration:radiologic characterization of age-related changes:cross-sectional and prospective analyses[J].Spine,2002,27(3):230-234.

17 Sahlman J,Inkinen R,Hirvonen T,et al.Premature vertebral endplate ossification and mild disc degeneration in mice after inactivation of one allele belonging to the Col2a1 gene for Type II collagen[J].Spine,2001,26(23):2558-2565.

18 Korecki CL,MacLean JJ,Iatridis JC.Characterization of an in vitro intervertebral disc organ culture system[J].Eur Spine J,2007,16(7):1029-1037.

19 Gantenbein B,Grunhagen T,Lee CR,et al.An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates:a feasibility study with ovine caudal discs[J].Spine,2006,31(23):2665-2673.

20 Adams MA,May S,Freeman BJ,et al.Effects of backward bending on lumbar intervertebral discs.Relevance to physical therapy treatments for low back pain[J].Spine,2000,25(4):431-438.

21 Adams MA,Bogduk N,Burton K,et al.The biomechanics of back pain[M].2nd ed.Edinburgh:Churchill Livingstone,2006.22 Zhu D.Micro-structure and mechanical properties of annulus fibrous of the L4-5 and L5-S1 intervertebral discs[J].Clin Biomech,2008,23(S1):S74-S82.

23 Iatridis JC,ap-Gwynn I.Mechanisms for mechanical damage in the intervertebral disc annulus fibrosus[J].J Biomech,2004,37(8):1165-1175.

24 Wagner DR,Reiser KM,Lotz JC.Glycation increases human annulus fibrosus stiffness in both experimental measurements and theoretical predictions[J].J Biomech,2006,39(6):1021-1029.

25 Adams MA,Dolan P,McNally DS.The internal mechanical functioning of intervertebral discs and articular cartilage,and its relevance to matrix biology[J].Matrix Boil,2009,28(7):384-389.

26 Hansma P,Turner P,Drake B,et al.The bone diagnostic instrumentⅡ:indentation distance increase [J].Rev Sci Instrum,2008,79(6):064303.

27 McMillan DW,Garbutt G,Adams MA,et al.Effect of sustained loading on the water content of intervertebral discs:implications for disc metabolism[J].Ann Rheum Dis,1996,55(12):880-887.

28 Botsford DJ,Esses SI,Ogilvie-Harris DJ,et al.In vivo diurnal variation in intervertebral disc volume and morphology[J].Spine,1994,19(8):935-940.

29 Przybyla A,Pollintine P,Bedzinski R,et al.Outer annulus tears have less effectthan endplate fracture on stress distributions inside intervertebral discs:relevance to disc degeneration[J].Clin Biomech,2006,21(10):1013-1019.

30 Weiler C,Nerlich AG,Zipperer J,et al.2002 SSE Award Competition in Basic Science:expression of major matrix metalloproteinases is associated with intervertebral disc degradation and resorption[J].Eur Spine,2002,11(4):308-320.

31 Pollintine P,Przybyla AS,Dolan P,etal.Neuralarch load-bearing in old and degenerated spines[J].J Biomech,2004,37(2):197-204.

32 Luo J,Skrzypiec DM,Pollintine P,et al.Mechanical efficacy of vertebroplasty:influence of cement type,BMD,fracture severity,and disc degeneration[J].Bone,2007,40(4):1110-1119.

33 Fairbank JC,Couper J,Davies J,et al.The Oswestry low back pain disability questionnaire[J].Physiotherapy,1980,66(8):271-273.

34 Davis RA.A long-term outcome analysis of 984 surgically treated herniated lumbar discs[J].J Neurosurg,1994,80(3):415-421.

35 Carlsson AM.Assessment of chronic pain.Ⅰ:Aspects of the reliability and validity of the visual analogue scale[J].Pain,1983,16(1):87-101.

36 Macnab I.Negative disc exploration.An analysis of the causes of nerve-root involvement in sixty-eight patients[J].J Bone Joint Surg Am,1971,53(5):891-903.

37 Geck MJ,Eismont FJ.Surgical options for the treatment of cervical spondylotic myelopathy[J].Orthop Clin North Am,2002,33(2):329-348.

38 杨克勤.脊柱疾患的临床与研究[M].北京:北京出版社,1993:653-654.

（续完）