CISH 技术在乳腺癌Her-2基因检测中的应用

张 伟 赵 军 陈晓东 彭大云 陈敬文 周永梅

(广州军区广州总医院病理科,广东510010;1广州市第十二人民医院,广东510620)

原癌基因Her-2是人类表皮生长因子受体家族的第二个成员,该家族中的受体均位于细胞膜上,在许多组织中都能发现[1]。乳腺癌居女性癌症发病率之首,研究显示 Her-2在20%-30%的乳腺癌中过度表达,与乳腺癌的侵袭转移及预后密切相关[2]。目前随着靶向药物曲妥珠单抗 (赫赛汀)的发展,乳腺癌复发率及死亡率大大降低,曲妥珠单抗 (赫赛汀)靶向治疗的关键是Her-2基因是否扩增,常用的 Her-2基因检测方法是免疫组化(IHC)法和荧光原位杂交 (FISH)法,但其结果之间一致性较差。我们应用美国ZYmed公司生产的Her-2显色原位杂交 (CISH)检测试剂,以探讨CISH技术在乳腺癌 Her-2基因检测中的应用。

材料和方法

1.标本与切片 标本来自广州总医院2006.01-2008.11间的手术切除乳腺癌标本50例,组织均经常规固定脱水处理,石蜡包埋,每例切片3-4μm,60℃烤片过夜。

2.方法:

2.1 IHC法 采用Envision法。

2.2 CISH法采用美国Zymed公司生产的地高辛标记的Her-2/neu原癌基因探针及放大系统检测试剂。按试剂盒说明书进行,切片常规脱蜡至水,加酶消化5min。将切片梯度酒精脱水,晾干切片。取10μl探针于盖玻片上,盖上组织,于杂交仪中 95℃变性 5min。37℃杂交过夜 (10h以上);次日柠檬酸缓冲液 (SSC)室温漂洗除去盖玻片,将切片置于另一75℃的SSC缸中5min,蒸馏水洗3次。免疫检测:3%双氧水5min,PBS洗3次,每次2min,滴加封闭液,室温10min,弃封闭液 (不洗),鼠抗地高辛抗体,室温 30min,PBS洗3次,每次2min,加HRP抗鼠抗体,室温30min,PBS洗 3次,每次 2min。DAB室温30min,自来水洗片刻,苏木素3-5s,‘自来水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封固。

结 果

1.结果判断

高拷贝扩增:在选定的计数区域内超过50%的肿瘤细胞,其核内有>10个 HER2信号颗粒,或者大簇团信号,或者多个信号颗粒与大簇团信号相混合。大簇团信号是形状不规则的一组信号,直径超过单个信号颗粒的5倍。应当用同一切片的肿瘤细胞或者正常上皮细胞的单个信号颗粒作为参考。

低拷贝扩增:在选定的计数区域内超过50%的肿瘤细胞,其核内有超过>5个但是少于10个的HER2基因信号颗粒,或者小簇团信号,或者多个信号颗粒与小簇团信号相混合。小簇团信号是一组形状不规则的信号,直径为单个信号颗粒的3到5倍。应当用同一切片的肿瘤细胞或者正常上皮细胞的单个颗粒作为参考。

无扩增:多倍体 在选定计数区域内有超过50%的肿瘤细胞,其核内有3到5个 HER2基因信号颗粒。在正常或者肿瘤细胞中,单个信号颗粒为圆形,边缘光滑。二倍体在选定计数区域内的超过50%的肿瘤细胞中,其核内有1到2个HER2基因信号颗粒。在正常或者肿瘤细胞中,单个信号颗粒为圆形,边缘光滑。

2.结果 50例中,其中11例 IHC Her-2(+++)(图1),有10例高拷贝扩增 (图2),1例低拷贝扩增 (图3)。25例 IHC Her-2(++)(图4)中有8例高拷贝扩增 (图5),10例低拷贝扩增,7例无扩增。6例 (+)和8例 (-)均无扩增 (图 6)。

讨 论

HER-2基因是否扩增不仅是预测乳腺癌预后的独立风险标记,同时还是 Herceptin单抗治疗和辅助化疗的重要参考指标,所以准确检测非常重要。目前公认的方法有两种:即免疫组化 (IHC)法和荧光原位杂交 (FISH)法。IHC技术因其操作简单,价廉,快速等特点已广为各病理科应用。但影响因素较多,该技术检测对象是Her-2受体蛋白,在标本固定和处理过程中容易变性破坏从而影响检测结果,抗体批号差异,抗体修复方法的不同以及结果判读的主观差异,和17号染色体的非整倍体现象,使 IHC结果准确率降低,假阳性问题无法避免。使不同医院之间的结果差异较大。与蛋白质检测相比,DNA的检测具有较高的稳定性。FISH检测与CISH检测的对象都是 Her-2的基因状态,然而FISH结果也会受到一些因素的影响,如标本的固定、烤片温度、蛋白质消化不当等,都会造成信号减弱或无信号[3]。尤其FISH实验设备昂贵,技术条件要求高,实验结果不能长期保存等原因,近年来已应用临床检测的CISH法[4],与FISH法相比,具有更好的前景。可用于福尔马林固定的石蜡切片;敏感性高、稳定性好、与FISH法有着相同的准确性[5];良好的定位性,普通光镜40倍可清晰地显示 Her-2基因扩增信号;结果可长期保存,操作简单,价格便宜。同时我们认为用IHC法筛选,若结果为 Her-2(++),再做 Her-2基因检测,若 Her-2结果为 (+)和 (-),可以不检测 Her-2基因。因此,IHC法作为乳腺癌患者 Her-2蛋白的初筛,再用CISH法检测 Her-2基因状态,是对临床运用 Herceptin治疗提供更准确依据的较理想的方法。

〔1〕曲建军.MUCI与 HER-2基因在乳腺癌中的研究进展.中国癌症杂志,2005,32(18):1073-1075

〔2〕Swiatoniowski G,Dabrowska M,Klaiewski T,et al.Erb-2 over-expression in breast cancer.Ginekol pol,2003,74(4):332-338

〔3〕曾瑄,赵大春,周炜洵,等.荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因状态.中华病理学杂志,2005,34:701-705

〔4〕虞有智,姜宝玉,陈定宝,等.显色原位杂交技术在乳腺癌 HER-2/neu原癌基因检测上的应用及意义.中华病理学杂志,2006,35:51-52

〔5〕GuptaD,Middleton L P,Whitaker M J,et al,Comparison of fluorescence and chromogenic in situ hybridization for detection of HER-2/neu oncogene in breast cacer.Am J Clin Pathol,2003,119:381-387

图 版 说 明

图1 Her-2(+++)。免疫组织化学 Envision法×200

图2 Her-2基因高拷贝扩增。显色原位杂交法×400

图3 Her-2基因低拷贝扩增。显色原位杂交法×100

图4 Her-2(++)。免疫组织化学Envision法×200

图5 Her-2基因高拷贝扩增。显色原位杂交法×200

图6 Her-2基因无扩增。显色原位杂交法×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Her-2(+++).IHC Envision method×200

Fig.2 High copy amplification of Her-2 gene.CISH method×400

Fig.3 low copy amplification of Her-2 gene.CISH method×100

Fig.4 Her-2(++).IHC Envision method×200

Fig.5 High copy amplification of Her-2 gene.CISH method×200

Fig.6 No amplification of Her-2 gene.CISH method×400