芹菜素对缺血再灌注大鼠心肌核转录因子-κB和 ICAM-1表达的影响

张慧芝 白建平 于肯明

(山西大同大学医学院药理教研室,037009)

在心血管疾病治疗过程中,许多常用和新发展的治疗措施都不可避免地造成缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI),因此缺血再灌注时的心肌保护越来越成为心血管领域的研究热点。核转录因子-κB(NF-κB)[1]是近年来研究较多并取得显著进展的一种核转录因子,调控着炎性细胞因子和粘附分子的表达,被认为是缺血心肌保护的一个新治疗靶点。芹菜素 (Apigenin,Api)是天然抗氧化剂,广泛存在于芹菜、苹果、桔子、车前子、络石藤、藿香等植物中,具有多种药理学作用,已成为药理学研究的热点。本实验采用芹菜素预处理观察大鼠缺血再灌注时心肌组织内NF-κB和粘附分子ICAM-1的变化,探讨芹菜素抗心肌IRI的可能机制。

材料和方法

1.实验药物 芹菜素:纯度≥98%,陕西慧科植物开发有限公司,批号:AP20050727。实验时芹菜素用聚乙二醇400(PEG400)和无水乙醇40℃水浴40min药物溶解后,再用生理盐水稀释为含10%的PEG400和10%的乙醇溶液。临用前配制。

2.动物 Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重220-250g,购自中国医学科学院实验动物研究所,动物合格证号:SCXK(京)2005-0013。

3.试剂与仪器 即用型 SABC (货号SA1022)、NF-κB p65多克隆抗体、ICAM-1多克隆抗体等,购自武汉博士德生物工程有限公司。BL-420E+生物机能实验系统、HX-300动物人工呼吸机和BI2000医学图像分析系统 (成都泰盟科技有限公司)。

4.方法

4.1 大鼠 MIRI模型制作 Wistar大鼠用20%乌拉坦 (1g/kg,ip)麻醉,用BL-420 E+生物机能实验系统记录Ⅱ导联心电图。颈部正中切口,气管插管,接人工呼吸机。于胸骨左侧2mm第四肋间开胸,开胸前打开人工呼吸机进行人工呼吸,频率为60次/min,呼吸比率为3:1,通气量20ml/kg。剪开心包膜,轻压胸廓,挤出心脏,在左心耳与肺动脉圆锥之间的左冠状动脉起始下方2-3mm处,用5/0医用无损伤缝合针于左心耳下方进针,将1号丝线穿过冠状动脉前降支下,将心脏复位,然后将丝线穿于自制的尖端球形冠脉阻断塑料管。稳定10min后,股静脉给药。除假手术组丝线空置,不拉紧丝线外,其他组给药后10min拉紧丝线,以塑料管球端压迫结扎左冠状动脉前降支30min后,放松结扎线,再灌注2h,并同步监测肢体Ⅱ导联心电图。实验中以左心室前壁紫绀及同步心电图II导联ST段抬高为结扎成功标志,以左心室前壁由紫绀逐渐红润及ST段降低1/2为再灌注的标志[2]。

4.2 动物分组及给药 Wistar大鼠随机分为6组,每组 10只,股静脉给药。①假手术(Sham)组:穿线后10min股静脉推注生理盐水4ml/kg,持续观察2h。②缺血再灌注 (IR)组:缺血前10 min股静脉推注生理盐水4ml/kg。③溶剂 (Solution,Sol)对照组:缺血前10min股静脉推注含10%(体积分数)PEG400和10%(体积分数)无水乙醇溶液4ml/kg。④阳性对照药维拉帕米组 (Verapamil,Ver):Ver用生理盐水配成0.1g/L,缺血前 10min以 4ml/kg股静脉推注。⑤、⑥Api低、高剂量组 (用 Api2、Api4表示):缺血前10min分别以2mg/kg、4mg/kg(芹菜素剂量的确定来自预实验结果)股静脉给药。

4.3 心肌苏木素碱性品红苦味酸 (Hematoxylin basic fuchsin picric,HBPF)染色:

各组大鼠再灌注2h后,迅速摘取心脏,取结扎部位以下左心室缺血心肌固定、脱水、常规石蜡包埋切片,行 HBPF染色 (缺血缺氧心肌呈鲜红色至深红色,正常心肌呈黄色或黄棕色)。

4.4 心肌 NF-κB、ICAM-1的免疫组化染色

石蜡切片后采用链酶亲和素 (SABC)免疫组化检测心肌NF-κB和 ICAM-1的表达。胞浆和血管内皮细胞着黄色至棕黄色颗粒为阳性表达,用灰度值反映免疫组化染色的深浅程度,数值越小,表示颜色越深,阳性程度越高。在100倍光镜下通过BI2000医学图像分析系统采集免疫组化图像,每张切片随机采取10个不重叠视野测量灰度值。

4.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示,多组间差异采用单因素方差分析,采用SPSS15.0统计软件完成。

结 果

1.H BPF染色结果

Sham组全部心肌纤维被染为黄色;IR组和Sol组大部分心肌纤维为红色;Api2组较多心肌纤维为红色,肌纤维呈灶状分布、Api4组和Ver组个别心肌纤维为红色,胞浆红色呈点状分布 (见图A)。

2.心 肌组织NF-κB表达和ICAM-1的变化

在Sham组心肌组织中,黄色颗粒仅散在少量表达于心肌细胞浆内;在IR组和Sol组大量心肌细胞浆和血管内皮细胞被染成棕黄色,颜色深染,在NF-κB染色中血管内皮细胞染色阳性强度高,在ICAM-1染色中心肌细胞浆染色阳性强度较血管内皮细胞高;在NF-κB染色中Api2组有较多的心肌细胞浆和血管内皮细胞被染成棕黄色,血管内皮细胞染色阳性强度高,颜色较 IR组和Sol组淡,Api4组有一定量的心肌细胞浆和血管内皮细胞被染成棕黄色,颜色淡染,Ver组有少量被染为黄色。在ICAM-1染色中Api2组一定量心肌细胞浆被染成棕黄色,血管内皮细胞染色较淡;Api4组和Ver组有较少量的心肌细胞浆被染成黄色,色淡,血管内皮细胞略有染色,染色淡。各组与Sham组比较,NF-κB和 ICAM-1表达明显增多,有显著性差异 (P<0.05);Api2组、Api4组与IR组比较,NF-κB和 ICAM-1表达明显减少,有显著性差异 (P<0.05);Api2组、Api4组之间比较,NF-κB和ICAM-1表达减少具有剂量依赖性,有显著性差异 (P<0.05)。IR组与Sol组,Api4组与Ver组,比较差异无显著性 (P>0.05) (见 表1及图B,C)。

表1 各组大鼠NF-κB和 ICAM-1免疫反应阳性产物灰度值 (¯x±s)Table 1 Gray value of immunoreactive products of NF-κB and ICAM-1 in each group

讨 论

核因子-κB(NF-κB)是一类与多种基因的启动子或增强子上的κB位点发生特异性结合并促进基因转录的蛋白质的总称。Sen R[3]最初发现在B淋巴细胞免疫球蛋白κ轻链基因增强子有特异性结合位点 (GGGGACTTTCC),后来发现在许多基因的启动子或增强子上都有一个或几个κB结合位点。具有这些启动子或增强子的基因包括 IL-1、IL-6、 TNF-α、 ICAM-1、 VCAM-1、 COX-2、NOS等。因此NF-κB在机体的免疫应答、炎症反应、重要脏器缺血再灌注损伤及细胞的生长调控中发挥重要作用[4]。在静息状态时,NF-κB通常与其抑制物IκB(inhibitory protein of NF-κB)直接结合形成无活性的三聚体。心肌缺血-再灌注时,启动多种物质的表达,而这些物质均能直接或间接造成心肌损伤;血管内皮细胞首先受到刺激,NF-κB被激活,启动多种物质的表达,包括 TNF-α、ICAM-1等,在这些因子的作用下,白细胞在缺血区血管中粘附、聚集,造成血管阻塞。同时,这些因子可促使白细胞穿内皮迁移、浸润并损伤心肌。聚集的白细胞又进一步释放炎性介质、氧自由基等加重缺血,造成血管及心肌损伤。另外,在上述过程中产生的因子如 TNF-α、IL-1等又是NF-κB的强诱导剂,会进一步激活NF-κB,形成恶性循环,加重缺血损伤的程度[5,6]。若调控NF-κB的信号转导途径,可以对心肌起到保护作用[7]。目前,许多以调控NF-κB信号途径为目标的实验方法正在为防治缺血/再灌注损伤探索一种新途径。

细胞间粘附分子 (ICAM-1)是免疫球蛋白超家族的成员,心肌细胞在正常情况下仅表达极少量的ICAM-1,但在某些病理因素如缺血再灌注、毒素及 TNF-α、IL-1和 IFN-γ等刺激下,其表达明显升高[8]。越来越多的证据也提示:中性粒细胞(PMN)浸润为主的炎症是造成心肌缺血再灌注损伤的重要因素之一。ICAM-1在激活PMN及促进心肌IR的发生和发展过程中起重要作用,是介导PMN粘附浸润的最重要因素之一。ICAM-1的高表达可刺激PMN与内皮细胞粘附,介导其对心肌细胞的浸润,引起并加剧心肌细胞的损伤,导致细胞死亡。缺血预适应可抑制 ICAM-1表达,抑制PMN聚集粘附,从而产生保护作用。缺血再灌注时,白细胞穿越血管壁到达效应组织的过程是一个非常复杂的环节,其中有两阶段是由ICAM-1介导的,ICAM-1表达的增加,进一步加重了炎症反应,也参与了心肌缺血再灌注损伤。

芹菜素是黄酮类化合物,大量的基础研究已证实芹菜素具有扩张血管调节血压、调节血脂、保护血管内皮细胞和改善血管舒缩功能等心血管药理作用[9],其机制之一可能是芹菜素可减少某些炎性介质,抑制炎性细胞浸润[10]。

在本实验中研究了缺血30min再灌注2h时NF-κB及 ICAM-1的表达,证实它们都参与了心肌IRI,芹菜素预处理后它们的表达又都随之下调,同时 HBPF染色结果提示心肌缺血缺氧程度减轻,说明抑制NF-κB的活性,降低 IRI后炎症因子ICAM-1的表达可能是芹菜素保护心肌IRI的重要机制。可认为芹菜素对缺血再灌注大鼠心肌NF-κB活化的抑制是 ICAM-1表达下调的分子机制。本实验结果也显示,钙拮抗剂维拉帕米对缺血再灌注心肌组织有较好的保护作用。芹菜素也具有钙拮抗作用[11],因此,减轻细胞内钙超载也可能是芹菜素对心肌缺血再灌注损伤保护的又一机制,但还需要进一步实验证实。此外,本实验排除了溶剂PEG400和乙醇对低、高剂量芹菜素组的影响。因此,芹菜素作为一种高效低毒的药物在防治MIRI方面具有很好的前景。

〔1〕Baldwin AS.The NF-κB and IκB proteins:New discoveries and insights.Annu Rev Immunol,1996,14(1):649-681

〔2〕Lindsten T,Ross AJ,King A,et al.The combined functions of proapoptotic Bcl-2 family members bax are essential for normaldevelopmentof multiple tissues.Mol Cell,2006(6):1389-1399

〔3〕Sen R,Baltimore D,Multiple nuclear factors interact with the immunoglobin enhancer sequences.Cell,1986,46:705-716

〔4〕Clermont G,Vergely C.Cellular injury associated with extracorporeal circulation.Ann Cardiol Angeiol(Paris),2002,51:38-43

〔5〕Sun B,Fan H,Honda T,et al.Activation of NF-κappaB and expression of ICAM-1 in ischemic reperfused canine myocardium.J Mol Cell Cardiol,2001,33:109-119

〔6〕吴佳妮,唐旭东,吴凡,等.抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及核因子κB活化的关系.西南军医,2007,9(3):31-33

〔7〕李鑫辉,黄政德.中医药对心肌缺血再灌注损伤的NF-κB信号转导调控作用研究进展.中西医结合心脑血管病杂志,2007,5(2):144-145

〔8〕殷惠军,王显刚.蒺藜总皂苷对大鼠IRI心肌 ICAM-1表达及中性粒细胞浸润的影响.解放军医学杂志,2006,6(31):534-535.

〔9〕Rossoni G,Grande S,Galli C,et al.Wild artichoke prevents the age-associated loss of vasomotor function.J Agric Food Chem,2005,53(26):10291-10296

〔10〕Tsai PJ,Chen YH,Hsueh CH,et al.Streptococcus pyogenes induces epithelial inflammatory responses through NF-kappaB/MAPK signaling pathways.Microbes Infect,2006,8(6):1440-1449

〔11〕Cattilli C,Cafferata EG,Genovese J,et al.TGF-beta1 up-regulates the mRNA for the Na+/Ca2+exchanger in neonatal rat cardiac myocytes.Cell Miol,1998,44(3):543-551