转录因子Ets-1与MMP-9在胃癌中的表达及临床意义

赵文娣 吴继锋 张 红 秦 蓉 沈裕欣 王道斌

(安徽医科大学病理学教研室,合肥230032; 1安徽医科大学第一附属医院中心实验室,合肥230022)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,临床上肿瘤复发和转移是导致其治疗失败的主要原因。肿瘤浸润转移的两个必要条件为肿瘤细胞侵犯并穿越基膜及细胞外基质所组成的屏障和肿瘤血管生成。研究发现,Ets转录因子家族成员 Ets-1(E26 tansformation-specific-1),通过转录激活一系列在细胞外基质重建和血管生成中起重要作用的基因的表达,如基质金属蛋白酶 (MMP)-1,-3,-9和尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)等,在肿瘤浸润转移中发挥重要作用[1]。目前国内外在胃癌中关于Ets-1与MMP-9的相关性研究未见报道。本研究采用免疫组化方法检测 Ets-1及MMP-9在胃癌、癌旁组织、正常胃黏膜组织中的表达,探讨两者在胃癌浸润转移中的作用、相互关系及临床意义。

材料和方法

1.材料 收集安徽医科大学第一附属医院病理科1999-2004年间胃癌手术切除标本97例,患者术前均未接受过抗肿瘤治疗。其中男75例,女22例;年龄29-76岁,中位年龄56岁。归类如下[2]:组织学类型:乳头状腺癌11例,管状腺癌49例,低分化腺癌20例,印戒细胞癌10例,黏液腺癌7例。浸润深度:侵及浆膜者76例,未及浆膜者21例。有淋巴结转移者75例,无淋巴结转移者22例。临床 TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期34例,Ⅲ、Ⅳ期63例。以97例癌旁组织以及另选取28例胃良性病变正常胃黏膜组织为对照。所有标本组织经10%甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,分别进行HE和免疫组化染色。

2.主要试剂与方法 兔抗人Ets-1多克隆抗体(C-20)购自美国 Santa Cruz公司,稀释度为1:200;即用型鼠抗人 MMP-9单克隆抗体(BA0362)购自福建迈新生物技术开发公司。免疫组化S-P法,操作按说明书进行,DAB显色。每批染色均用已知阳性切片作阳性对照 (Ets-1用人肾上腺组织,MMP-9用人乳腺癌组织),用 PBS代替一抗作阴性对照。

3.结果判定 免疫组化结果由两名医师记录,并独立阅片。每例选择10个高倍视野 (×40),Ets-1以细胞胞质和 (或)细胞核内出现黄色或黄褐色颗粒为阳性[3]。MMP-9以胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为3级:<10%为阴性 (-);10%-50%之间为阳性 (+);>50%为强阳性 (++)。

4.统计学分析使用SPSS 13.0 for window软件进行统计学处理,根据资料性质分别采用Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis法、χ2检验。

结 果

1.E ts-1和MMP-9在正常胃黏膜、癌旁组织及胃癌组织中表达

Ets-1阳性染色定位于细胞质和 (或)细胞核内。Ets-1主要表达于胃癌细胞 (图1),在97例胃癌组织中阳性率为74.2%(72/97);部分癌旁黏膜组织中也见Ets-1阳性表达,主要见于肠化和非典型增生上皮 (图2),阳性率为40.2%(39/97);在28例正常胃黏膜组织中,Ets-1阳性表达仅局限于固有层腺体内的少量细胞 (图3),阳性率为17.9%(5/28),且无强阳性表达。MMP-9主要表达于胃癌细胞胞质中 (图4)。MMP-9在胃癌组织、癌旁组织、正常胃黏膜组织中阳性率分别为75.3%、18.6%、14.3%。Ets-1和 MMP-9在胃癌组织中的表达率明显高于癌旁组织及正常胃黏膜组织 (P<0.05);而癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达差异无显著性 (P>0.05)。

根据不同组织学类型分组比较,Ets-1和MMP-9表达与胃癌组织学类型有明显相关性,在黏液癌 (印戒细胞癌/黏液腺癌)中的表达明显低于其它类型癌中的表达 (P<0.01)(见图5、6,表1)。

2.E ts-1、MMP-9的表达与胃癌临床病理因素间的关系

Ets-1和MMP-9在侵及浆膜组的胃癌组织中表达明显高于未及浆膜组 (P<0.01),在有淋巴结转移组表达明显高于无淋巴结转移组 (P<0.01);临床分期中Ⅲ、Ⅳ期组表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期组 (P<0.01),而与年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤位置均无关 (P>0.05)(见表2)。

3.E ts-1和MMP-9在胃癌组织中表达的关系

胃癌组织中Ets-1和MMP-9蛋白表达均阳性者67例 (69.1%),均为阴性者19例 (19.6%)。Ets-1阳性而 MMP-9阴性 5例;Ets-1阴性而MMP-9阳性6例。两者表达呈正相关 (r=0.700,P<0.01)。(表 3)。

表1 胃癌各组织类型、癌旁组织及正常胃黏膜组织中Ets-1、MMP-9蛋白的表达Table 1 The expressions of Ets-1 and MMP-9 protein in histologic types of GC,adjacent tissue and in normal gastric mucosal tissue

表2 胃癌组织中Ets-1和MMP-9的表达与临床病理因素的关系T able 2 Relationship between Ets-1,MMP-9 positive expressions and clinical pathological features of GC

表3 胃癌组织中 Ets-1和MMP-9蛋白表达之间的关系T able 3 Relationship between Ets-1 and MMP-9 protein in GC

讨 论

Ets-1基因是从禽类白血病逆转录病毒E26基因组中分离出的癌基因,其编码产物Ets-1是一种转录因子,Ets-1是Ets家族中具有代表性的成员。Ets家族是一组转录因子群,它们都具有由85个氨基酸构成的进化保守的DNA结合区,形成一个螺旋-转角-螺旋 (helix-turn-helix)结构,称为Ets结构域 (Ets domain),这个结构域识别靶基因启动子区的一个富含嘌呤的 GGAA/T核心基序[1]。Ets-1作为转录因子参与细胞的增殖分化、血管生成、细胞凋亡等过程,同时在肿瘤浸润转移中也发挥重要作用,主要与某些降解细胞外基质酶的转录激活有关,这些酶包括基质金属蛋白酶 (MMPs)等[4]。

Nakayama等[3]认为 Ets-1高表达可能是胃癌多步骤发生过程的一个环节。Nagarajan等[5]通过研究高表达 Ets-1的转基因老鼠发现,Ets-1在皮肤鳞癌的发生中起作用,Ets-1高表达可以诱发老鼠皮肤鳞状上皮出现非典型增生、甚至深部浸润的表现,同时伴有MMPs表达升高。本研究发现,Ets-1和MMP-9在胃癌组织中均有较高的阳性表达率,且明显高于正常胃黏膜及癌旁组织,提示胃粘膜中Ets-1高表达可能对胃癌发生、发展起重要作用。我们推测Ets-1在胃癌发生、发展中所起的作用可能是通过其下游分子MMPs等,增强了细胞分解基底膜及形成新生血管的能力。也可能因其本身是一种原癌基因,过表达进而促进了细胞的恶性转化。

研究同时发现,在胃癌不同组织学分型中,印戒细胞癌和黏液腺癌Ets-1的阳性表达率显著低于乳头状腺癌、管状腺癌及低分化腺癌,甚至低于癌旁组织。我们推测由于肿瘤浸润转移受多种机制调控,黏液癌具有与其它组织学类型不同的浸润转移机制[3];也可能和黏液癌的组织起源与其它类型不同有关。

MMPs是一组与肿瘤浸润转移关系十分密切的蛋白水解酶,MMP-9是MMPs家族中的重要成员,又称为 IV型胶原酶 (type IV collagenase)或明胶酶B(gelatinase B),其作用底物为明胶蛋白、IV和V型胶原等构成 ECM的重要成份。MMP-9通过破坏基底膜和对细胞外基质的改建,促进肿瘤新生血管的形成,利于肿瘤的浸润转移。本研究发现,Ets-1和MMP-9的高表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移及临床分期有关,且胃癌组织中Ets-1和MMP-9的表达具有显著相关性。Ets-1作为转录因子对MMP-9蛋白的表达具有诱导作用:Ets-1识别靶基因上的一段中心为 GGAA/T核心基序,称为 Ets结合位点 (Ets binding site,EBS)或 PEA3元件 (PEA3 element)。所有MMPs基因的启动子区 (除MMP-12外)都含有PEA3元件。Ets-1通过与转录因子AP-1(c-fos/c-jun)的协同作用,激活MMPs基因[4,6]。我们推测通过上调MMP-9的表达,使基底膜及细胞外基质降解,可能是Ets-1促进胃癌浸润转移的机制之一。通过上调基质降解酶类的表达,增强对细胞外基质的降解,使癌细胞向组织深层浸润的同时也突破淋巴管和血管的基底膜而向脉管浸润,最终发生转移。

因此可以设想通过抑制Ets-1的活性达到抑制肿瘤浸润转移的目的。Sahin[7]等用一显性失活的无转录激活功能的 Ets-1-DB蛋白竞争抑制 Ets-1,发现逆转录病毒介导的 Ets-1-DB蛋白抑制了胶质瘤细胞的增殖、侵袭及肿瘤细胞MMP-9的表达。Taniguchi[8]等采用 decoy寡核酸技术,向胃癌细胞裸鼠腹腔内种植的动物模型腹内注射Ets-1 decoy寡核苷酸后,抑制了种植瘤的生长,延长了实验动物的生存期。总之,随着研究的深入,针对转录因子Ets-1的靶向抑制可能为胃癌治疗提供新的思路。

〔1〕Dittmer J.The biology of the Ets1 proto-oncogene.Mol cancer,2003,2(29):1-21

〔2〕Hamilton SR,Aaltonen LA.World Health Organization classification of tumors.Pathology and genetics of tumors of digestive system.Lyon:IARC Press,2000,38-46

〔3〕Nakayama T,Ito M,Ohtsuru A,et al.Expression of Ets-1 proto-oncogene in human gastric carcinoma:correlation with tumor invasion.Am J Pathol,1996,149(6):1931-1939

〔4〕Singh S,Barrett J,Sakata K,et al.Ets proteins and MMPs:partners in invasion and metastasis.Curr Drug Targ,2002,3(5):359-367

〔5〕Nagarajan P,Parikh N,Garrett-Sinha LA,et,al.Ets1 Induces Dysplastic Changes When Expressed in Terminally-Differentiating Squamous Epidermal Cells.PLoS one,2009,4(1):1-15

〔6〕Okuducu AF,Zils U,Michaelis SA,et al.Increased expression of avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 in World Health Organization grade 1 meningiomas is associated with an elevated risk of recurrence and is correlated with the expression of its target genes matrix metalloproteinase-2 and MMP-9.Cancer,2006,107(6):1365-1272

〔7〕Sahin A,Vercamer C,Kaminski A,et al.Dominantnegative inhibition of Ets 1 suppresses tumor growth,invasion and migration in rat C6 glioma cells and reveals differentially expressed Ets 1 target genes.Int J Oncol,2009,34(2):377-389

〔8〕Taniguchi H,Fujiwara Y,Doki Y,et al.Gene therapy using ets-1 transcription factor decoy for peritoneal dissemination of gastric cancer.Int J Cancer,2007,121(7):1609-1617

图 版 说 明

图1管状腺癌Ets-1强阳性表达 (++),定位于癌细胞胞质及胞核 (S-P法 ×400)。

图2癌旁组织 Ets-1弱阳性表达 (+)。(S-P法 ×100)。

图3正常胃黏膜组织 Ets-1弱阳性表达 (+) (S-P法 ×100)。

图4管状腺癌MMP-9强阳性表达 (++),定位于癌细胞胞质 (S-P法 ×400)

图5印戒细胞癌 Ets-1阴性表达 (-)(S-P法 ×100)。

图6粘液腺癌MMP-9阴性表达 (-)(S-P法 ×100)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of Ets-1 protein is strong positive in cytoplasm and mucleioftubularadenocarcinoma(++).S-P method×400

Fig.2 The expression of Ets-1 protein is weak positive in pericancerous tissue(+).S-P method ×100。

Fig.3 The expression of Ets-1 protein is weak positive in normal mucosa(+).S-P method×100

Fig.4 The expression of MMP-9 protein is strong positive in cytoplasm of tubular adenocarcinoma(+ +).S-P method ×400。

Fig.5 The expression of Ets-1 protein is negative in signetring cell carcinoma(-).S-P method×100

Fig.6 The expression of MMP-9 protein is negative in mucinous adenocarcinoma(-).S-P method×100