HPLC波长切换法同时测定淡竹叶中3种成分的含量

郭 妍， 郭晏华

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600)

淡竹叶为禾本科草本植物淡竹叶(Lophatherum gracile Brongn)的干燥茎叶［1］。主产于湖南，浙江，安徽，四川等省，是一味清心火，除烦热，利小便的良药，对治疗热病口渴，心烦不安，口糜舌疮，牙龈肿痛，小便赤涩淋痛，颇有疗效［2］。淡竹叶中含有大量的黄酮，内酯，氨基酸和糖类等成分，其中的黄酮类化合物具有降脂，抗血栓，抗氧化，降糖等多种生理活性，近年来受到国内外学者的关注。本实验测定了淡竹叶药材中3种指标性成分的含量［3］，并比较了不同来源药材质量优劣，为临床评价淡竹叶质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型四元泵高效液相色谱仪、SPD-10A紫外检测器、SHB-3循环水多用真空泵、UV-4802型紫外-可见分光光度计、SHIMADZU AY220型电子分析天平、HH-4数显恒温水浴锅。

1.2 试药 反式对香豆酸对照品由天津一方科技公司提供，香草酸对照品(批号:110776-200402)，牡荆素(苷)(批号:111687-200501)均购于中国药品生物制品检定所。本研究收集了15个不同来源的淡竹叶药材，经辽宁中医药大学李峰教授鉴定均为正品药材。甲醇为色谱纯，冰乙酸等均为分析纯，水为重蒸馏水。其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

采用 AgiLent EcLipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱对流动相的组成、配比、体积流量等因素进行分析，对检测波长进行选择，确定最佳色谱条件。

2.1.1 流动相系统的选择 精密吸取供试品溶液10 μL进样，分别以甲醇-3%冰乙酸水、乙腈-3%冰乙酸水、甲醇-0.5%磷酸水溶液等不同浓度、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱，比较不同洗脱条件的色谱图，选择分离效果好，时间尽可能短的最佳色谱条件，最终确定以甲醇(A)-3%冰乙酸(B)为流动相进行梯度洗脱。流速:1.0 mL/min;柱温:30℃。见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.1.2 检测波长的选择 取一定浓度的香草酸，反式对香豆酸，牡荆素对照品置U-3010型紫外分光光度计下扫描，香草酸在260 nm有最大吸收，反式对香豆酸在308 nm有最大吸收，牡荆素在331 nm有最大吸收，为兼顾3种成分在同一色谱图上均有最大吸收，因此选用波长切换法。波长切换程序为:0 min→260 nm、30 min→308 nm、60 min→331 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取香草酸，反式对香豆酸，牡荆素对照品适量，分别置10 mL棕色量瓶中加甲醇溶解，制得浓度为0.276 mg/mL、0.223 mg/mL、0.231 mg/mL的对照品贮备液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取淡竹叶药材(过40目筛)1.5 g，加入60%乙醇60 mL(pH=3)，加热回流2 h，过滤。滤液蒸干，加热水15 mL，超声使溶解，离心10 min，转速为3 000 r/min。取处理好的大孔吸附树脂［4］(AB-8)5 g装入柱中(1 cm×24 cm)，离心液以2 BV/h流速上样(BV为树脂柱床体积)，静吸附20 min。先用4 BV水冲至流出液无色，再用5 BV 20%乙醇冲洗至无色，然后用5 BV 40%乙醇冲洗至无色，最后用5 BV 60%乙醇冲洗至无色。最终收集40%和60%乙醇流出液，浓缩，用60%乙醇定容至10 mL量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，备用。

2.4 系统适用性试验

精密吸取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，在选定的色谱条件下香草酸，反式对香豆酸和牡荆素的理论塔板数均不少于10 000，各成分与其他峰的分离度分别为 4.8，1.7，3.2。见图 1。

图1 混合对照品(A)和样品(B)HPLC谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备 精密吸取香草酸对照品贮备液0.1 mL，反式对香豆酸对照品0.5 mL，牡荆素对照品3 mL置同一棕色5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得对照品混合液。精密吸取 4，8，12，16，20 μL 注入高效液相色谱仪，测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得香草酸回归方程为:Y=6 249.3X，r=0.999 3;反式对香豆酸回归方程为Y=9043.7X，r=0.999 8;牡荆素回归方程为Y=2 853.7X，r=0.999 9;结果表明:香草酸在0.022 08～0.110 4 μg范围内线性关系良好;反式对香豆酸在0.089 2～0.446 μg范围内线性关系良好;牡荆素在0.554 4～2.772 μg范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 取淡竹叶药材(1号)供试品溶液连续进样5次，记录色谱峰面积，结果香草酸、反式对香豆酸和牡荆素峰面积的RSD分别为2.2%、2.1%和2.8%。结论:结果表明，本方法精密度较好。

2.5.3 稳定性试验 取淡竹叶药材(1号)供试品溶液在0、2、4、8、12 h分别进样分析，记录色谱峰面积，结果香草酸，反式对香豆酸和牡荆素峰面积的RSD分别为2.9%、2.0%和2.5%。结论:结果表明，样品在本实验条件下稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批淡竹叶药材(1号)样品5份，按供试品制备方法制备供试品溶液，并进样分析，结果RSD为香草酸2.9%，反式对香豆酸2.2%和牡荆素2.2%。结论:结果表明，本方法重复性较好。

2.5.5 回收率试验 取已知含量的药材(1号)5份，每份约0.75 g(香草酸含量0.040 17 mg/g，反式对香豆酸0.2084 mg/g，牡荆素1.532 mg/g)精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入香草酸对照品1 mL(浓度为0.0276 mg/mL)、反式对香豆酸7 mL(浓度为0.0223 mg/mL)和牡荆素(浓度为0.231 mg/mL)5 mL，照供试品溶液制备方法制备。求得平均回收率分别为100.3%、100.2%和99.0%;RSD分别为2.5%、2.2%、1.4%。结论:结果表明，本方法回收率较高。

2.6 淡竹叶药材中香草酸，反式对香豆酸和牡荆素的含量测定

取不同来源的淡竹叶药材粉末(过40目筛)各约1.5 g，精密称定，制备供试品溶液，吸取各溶液10 μL，注入高效液相色谱仪。每个样品平行测定5次，计算各成分含量平均值及RSD。结果见表2。

表2 不同来源淡竹叶中3种成分的含量

3 讨论

3.1 本实验首次采用高效液相色谱法同时测定了淡竹叶药材中香草酸、反式对香豆酸、牡荆素3种指标性成分，更好地控制了药材的质量，并且实验方法准确可靠，灵敏度高、重现性好，为淡竹叶药材的质量评价提供了有价值的参考。

3.2 通过对照品贮备液在200～400 nm进行紫外波长扫描，得出各自的紫外吸收曲线，根据相应的出峰时间确定波长切换梯度，使3种成分均在最大吸收波长测定，使测定结果更加灵敏、准确。

3.3 本实验比较了超声提取、水浴回流提取和索式提取的提取效果，最终确定水浴加热回流是最佳提取方法。同时通过正交设计实验考察了提取溶剂，提取时间，溶剂用量和提取次数对提取效果的影响。结果表明，以60%乙醇、60 mL、加热回流2 h提取效果最好。验证了提取时间过长使牡荆素(苷)降解，提取含量并不高。考虑到3种成分均偏酸性，因此加入盐酸调pH=3，使3种成分充分游离出来，便于提取完全。

3.4 淡竹叶药材中含较多如氨基酸，糖类等大极性成分，药材提取液杂质较多，直接测定会影响所测成分的分离度并且达不到基线，影响各成分的准确测定，因此采用大孔吸附树脂除杂。本实验考察了不同极性大孔吸附树脂处理效果，比较各经过处理的样品色谱图，最终选用AB-8大孔吸附树脂。该树脂能使淡竹叶药材提取液中的杂质除去，色谱图各峰之间分离度较好，达到基线分离，并且使所测3种成分损失较少。本实验考察了该树脂对淡竹叶药材提取液的吸附与解析能力，确定了最佳上样量、流速、所用洗脱溶剂乙醇的浓度梯度及洗脱溶剂体积。最终收集40%和60%乙醇流出液，经处理测定含量。

3.5 从表2可以看出不同来源的淡竹叶3种指标性成分含量差别很大，来自甘肃、上海、鞍山、沈阳的药材与其他商品地的相比含量较低。这可能由于是受生长环境不同所致。因此，淡竹叶应用于临床之前应对其质量进行评价。

［1］中国药典［S］.一部.2005.

［2］宋秋烨，吴启南.中药淡竹叶的研究进展［J］.中华中医药学刊，2007，25(3):526-527.

［3］陈 泉，吴立军，王 军，等.中药淡竹叶的化学成分研究［J］.沈阳药科大学学报，2002，19(1):23-24.

［4］周 媛，程 凡.大孔树脂对葛根总黄酮的吸附及分离纯化研究［J］.时珍国医国药，2007，18(12):3009.