羟基磷灰石和碳酸羟基磷灰石结构和细胞相容性的对比研究

朱庆霞 徐琼琼 刘欣

(景德镇陶瓷学院，景德镇：333001)

1 引言

人体自然骨中磷灰石矿物主要是非化学计量的磷灰石晶体，碳酸根是骨磷灰石中含量最多的掺杂离子。碳酸根能替代羟基磷灰石（HA）晶格中的羟基或磷酸根，分别形成A型或B型替代，或同时占据两个位置，形成AB型替代的碳酸羟基磷灰石（CHA）[1]。在人体骨中的CHA以B型替代为主，A型和B型替代的摩尔比大约为0.7～0.9[2]。碳酸根的替代会导致HA生物学性能的变化[3-5]，有学者通过细胞培养实验研究了碳酸根替代对生物相容性的影响，然而所研究的对象集中在固相离子交换法制备的以A型替代为主的CHA[6-8]，而对B型替代为主CHA的生物相容性研究却未见报道。材料的生物学性能与表面能密切相关。因此本文研究了以B型替代为主的碳酸根对磷灰石晶体结构和表面能的影响，并采用羊骨髓基质细胞建立了体外评价模型，研究了表面能对细胞贴附和增殖的影响，进而对材料的细胞相容性进行评估。

2 实验

以硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)、磷酸氢二铵((NH4) 2HPO4)为原料，控制Ca(NO3)2·4H2O与(NH4)2HPO4的摩尔比为1.67，以适当的速度将(NH4)2HPO4溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中制备HA。以Ca(NO3)2· 4H2O、(NH4)2HPO4和NaHCO3为原料，控制Ca(NO3)2· 4H2O,(NH4)2HPO4和NaHCO3的摩尔比为1.67∶1∶0.44,以适当的速度将(NH4)2HPO4和NaHCO3的混合溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中制备CHA。在整个反应过程中，通过滴加氨水调节溶液的pH值在10～11之间，反应温度为90℃。反应结束后，继续搅拌3 h，然后在室温下陈化24 h，再用蒸馏水洗涤、离心、过滤、120℃干燥。

2.2 样品的制备

将CHA和HA粉体在250 MPa等静压作用下压成块体，将CHA块体和粉体置于自制的石英管式炉内，通入湿二氧化碳气体（其中湿气的带入是将气体在进入石英管式炉前，流经室温下盛有蒸馏水的三口瓶而实现的），在800℃热处理2 h，升温速率为5℃/min，二氧化碳流量为1L/min，经元素分析热处理后CHA样品的碳酸根含量为5.4wt%。作为对比，将HA块体和粉体在空气气氛中1000℃热处理2 h。两种块体烧后致密度均为0.91，样品抛光先经过1200目的砂纸打磨，然后是氧化铝抛光粉抛光。抛光处理后的样片经XRD分析，没有发生分解。

2.3 细胞相容性实验

观察成骨细胞在种植体表面上的细胞动力学特性及功能表达，是研究材料细胞相容性的重要方法。要取得种植体的早期稳定，必须能够使成骨细胞在材料表面早期附着和增殖。实验步骤如下：

2.3.1 消毒

CHA和HA块体经相同的抛光处理后，以丙酮超声清洗5分钟，然后用95%无水乙醇清洗5分钟，再用去离子水冲洗3遍，40℃烘干，高温高压消毒，备用。

2.3.2 接种

取第三代羊骨髓基质干细胞，采用DMEM细胞培养液 (含100 IU/mL盘尼西林,100 mg/mL链霉素和10%血清)制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL；将材料放置于48孔培养板中，分别在每片材料上面用移液器滴加细胞悬液100μL，小心将培养板放置于37℃，5%CO2的孵育箱中。

2.3.3 细胞贴附率检测

分别培养4h，8h，16h后从每个实验组各取出3个试样，置于新的培养板内，D-Hanks液漂洗3次，吸净液体。每孔加入100μL浓度为0.25%的胰酶消化2min后，再加入100μL含血清的培养液，中止消化，用移液器反复吹打材料表面，待表面细胞完全消化下来后，将液体转移至 500μL离心管内，800rpm，5min离心，吸弃上清，加入100μL培养液重新悬浮细胞，血球计数板计数，每个试样重复三次，取平均值。

细胞贴壁率=（贴壁细胞数/接种细胞数）×（培养孔底面积/试样面积）×100%

2.3.4 细胞增殖率检测

将培养4d，8d，16d后的材料每种各取三片，照上述方法消化后计数。

细胞增殖率=（增殖细胞数/接种细胞数）×（培养孔底面积/试样面积）×100%

2.4 样品性能的表征

用 X射线衍射（X-ray diffraction,XRD)仪(PANalytical X'pert PRO,Netherlands)慢速扫描来确定峰位的准确位置，工作条件为管压40 kV，管流40 mA，2θ 的步长为 0.02°。用 Fourier变换红外（Fourier transform infrared,FTIR）光谱仪 (Nexus, Nicolet,USA)分析样品的分子基团，特别是碳酸根的振动。用躺滴法（A sessile drop method）接触角测定仪(OCA15，dataphysics,Germany)测量实验液体在样品表面的接触角。对于每种实验液体最少选用3个平行样，每个平行样品平均进行6～7个接触角测量。

3 结果与讨论

图1 C H A与H A粉料的F T I R图谱Fig.1 FTIR spectrum of CHA and HA

图1是热处理后CHA与HA粉料的FTIR图谱。除PO43-的峰 (1090、1040、962、600、570 cm-1)之外，存在着羟基（OH-O）位于3570 cm-1的伸缩振动峰和位于630 cm-1的弯曲振动峰。对比图1.a和b，可以看出，CHA的羟基伸缩振动峰强度明显减弱，且630 cm-1处的弯曲振动只存在不太明显的肩峰。这是由于有部分碳酸根替代了HA晶格的羟基，发生了A型替代，从而使得羟基的振动强度减弱。而在图1a CHA的FTIR图谱中，还出现了1470，1460，1420以及 875cm-1处 CO32-的振动峰，尤其是 1400～1500cm-1间C-O反对称伸缩振动吸收带出现了分裂，它不同于碳酸盐或自由基CO32-中的单峰，该分裂峰表明CO32-已经进入到羟基磷灰石晶格内部[9]。其中1420cm-1是B型替代的伸缩振动峰，1460cm-1是B型替代的弯曲振动峰，1470cm-1是A型替代的伸缩振动峰。而 875cm-1处的碳酸根振动峰是870cm-1B型替代和880cm-1A型替代的重合峰，其中870cm-1和880cm-1的峰强之比近似于碳酸根的B型和A型替代之比[10]。通过计算机拟合分峰技术，可得CHA的A/B=0.72。故通过红外分析可知所制得的CHA是以B型替代为主。这是因为以湿法制备CHA时，要考虑溶液中OH-和CO32-竞争占据HA晶格羟基位的情况。当CHA在碱性条件下制备时，高浓度的OH-更容易占据HA晶格的A位，迫使更多的碳酸根进入HA晶格的B位，形成B型替代。而在本实验中，溶液的pH值是在10～11之间。所以，高pH值的制备条件有利于获得以B型替代为主的CHA。红外光谱中特征吸收带的宽窄、尖锐程度可以反映矿物的结晶程度[11]。结晶程度较低时，矿物内部结构排列变得不规则，对称性降低，形成一些宽而钝的峰，随着结晶程度的提高，原来宽泛的吸收带频率范围缩小，吸收带锐化。对比图1（a）和（b）可以看出，HA样品位于1100～900 cm-1处磷酸根的非对称伸缩振动峰的峰形尖锐，而在CHA样品中，峰形宽而钝，有双峰合并只形成一个弥散峰的趋势，表明CHA的结晶度比HA低。

图2是热处理后CHA与HA粉料的XRD衍射图。从图2可以看出，CHA与HA粉料的最强峰值都在31.5°到32°之间，主晶相为磷灰石相。但在CHA的衍射图中，特征峰的峰位都发生了偏移，而峰位的偏移反映了晶体结构的变化。由于碳酸根的晶胞体积小于磷酸根，而大于羟基的晶胞体积，故当发生替代时，形态和大小的差别会明显地反映在晶胞参数的变化上。当发生A型替代时，碳酸根离子的三角形平面平行于c轴，当发生B型替代时，碳酸根离子的三角形平面垂直于c轴，从而B型替代使得c/a增加，A型替代使得c/a减小[12]。从FTIR光谱的分析可以知道，本实验生成的CHA是以B型替代为主的混合型替代，根据六方晶系晶面距的计算公式[13]：

图2 C H A与H A粉料的X R D衍射图Fig.2 XRD patterns of CHA and HA

从而（210）、（300）晶面由于a值的减小，d值减小，峰位向高角区移动；而（002）晶面由于c值的增大，d值增大，从而峰位稍微向低角区移动。并且从图中还可以看出，引入CO32-使得磷灰石特征峰的半高宽发生变化，CHA的半高宽明显比HA峰的半高宽要大，说明CHA比HA的结晶程度差，与上述FTIR分析相符。这主要是由于碳酸根的替代引起晶格畸变，这种畸变阻碍HA的进一步结晶，使其结晶程度变差，结晶度降低。

3.3 表面能的测定

在本研究中，接触角的测定选用了三种实验液体：丙三醇、双蒸水和甲酰胺。丙三醇和甲酰胺用来确定样品表面能的色散分量，极性分量通过双蒸水与样品的相互作用能获得。图3为样品的动态接触角（θ）。

试样表面能（γs）数据由Owens-Wendt-Kaeble's方程计算求得[14]：

式中，γ的下标s,l和g分别表示固、液和气，上标d和p分别表示相应表(界)面张力的色散分量和极性分量。将实验液体的表面能数据（丙三醇63.4mJ/m2双蒸水甲酰胺代入，可得试样的表面能。

图3 样品动态接触角Fig.3 Dynamic contact angles between(a)CHA and glycerol,(b)HA and glycerol,(c)CHA and doubledistilled water,(d)HA and double-distilled water

经计算，CHA样品的表面能为50±2mJ/m2，高于HA样品的表面能（43±2mJ/m2），但表面能的色散分量相近，HA和CHA表面能的色散分量分别为34±3mJ/m2和33±2mJ/m2，这表明碳酸根的B型替代使得CHA与极性组分（包括骨细胞、蛋白质等）作用增强。此外，同一样片同一实验液体测出接触角数据的重复性也表明了所制得样品化学成分的稳定性。固体表面组分和表面粗糙度等对接触角有明显的影响[16]。CHA样品和HA样品在测试前经过相同的样品制备过程，其表面粗糙度和致密度基本一致，其表面能的不同主要是由碳酸根替代导致样品表面组分的变化引起的。并且碳酸根不同类型的替代对表面能的影响也是不同的。S.A.Redey[5-6]等人研究了A型替代的CHA，发现其表面能的极性分量低于HA表面能的极性分量，从而导致成骨细胞在其表面吸附量较少，胶原的生成量也较少。本研究所制备CHA样品以B型替代为主，这种类型的替代导致了表面能，特别是极性分量的升高，从而必将有利于细胞的早期吸附。

3.4 样品的细胞培养实验

图4（a）是早期细胞附着率的实验结果。与HA样品相比，CHA样品高的细胞贴壁率明显是和成骨细胞与CHA表面较高的亲合力有关。表面能的测试数据表明，当碳酸根发生B型替代，HA与水的极性互作用能增加，表面能增加。根据平衡系统的最小能量定律，细胞在高能表面贴附和伸展良好。因此，表面能能影响成骨细胞在HA样品和CHA样品的早期贴附，这与先前关于润湿性对各种细胞贴附和伸展影响的研究结果相吻合[17-18]。另一方面，从图4（b）细胞增殖率的实验结果可以看出，虽然CHA样品的早期贴附率高于HA样品，但在细胞增殖方面并没有太大的区别。这说明，HA样品表面与成骨细胞较差的亲合力只是延缓了早期的细胞贴附，并没有改变细胞的增殖与分化。这可能是由于碳酸根的替代导致CHA结构无序化，提高了溶解度，从而其表面含较多钙磷元素，在培养液中钙离子的溶出会引起表面pH值发生变化，抑制了细胞的生长[19]。从而，培养8天后，HA样品和CHA样品细胞增殖率已经比较接近。

4 结论

（1）湿化学法碱性条件下制备的碳酸羟基磷灰石是以B型替代为主的碳酸羟基磷灰石。

（2）碳酸根的B型替代导致表面能的升高，其表面能的极性分量高于HA表面能的极性分量。

图4 不同时间点材料表面细胞附着率和增殖率Fig.4 Cell attachment rate and cell proliferation rate versus time

（3）表面能的升高有利于细胞的早期吸附，以B型替代为主的CHA细胞相容性好，成骨细胞能够在材料表面良好黏附和增殖。

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