一种新型可切削生物活性玻璃陶瓷的微核实验

郝玉全，阎秀林，张旖骁，韩雪松，刘敏达，艾红军

（1.中国医科大学 口腔医学院口腔修复科，沈阳 110002；2.中国医科大学 口腔医学院口腔正畸科，沈阳 110002；3.中国医科大学 第94期临床医学系，沈阳 110001；4.武警辽宁省总队医院 口腔科，沈阳 110034；5.中国医科大学 第93期口腔医学系，沈阳 110001）

一种新型可切削生物活性玻璃陶瓷的微核实验

郝玉全1，阎秀林2，张旖骁3，韩雪松4，刘敏达5，艾红军1

（1.中国医科大学 口腔医学院口腔修复科，沈阳 110002；2.中国医科大学 口腔医学院口腔正畸科，沈阳 110002；3.中国医科大学 第94期临床医学系，沈阳 110001；4.武警辽宁省总队医院 口腔科，沈阳 110034；5.中国医科大学 第93期口腔医学系，沈阳 110001）

目的 评价一种新型可切削生物活性玻璃陶瓷的潜在致突变性。方法 将30只N1H纯系小鼠随机等分为玻璃陶瓷组、阴性对照组和阳性对照组。玻璃陶瓷组将待测样品制成粉末状，用阿拉伯胶将其配成混悬液，以5g/kg的剂量经口灌胃；阴性对照组和阳性对照组分别灌注等体积的阿拉伯胶和环磷酰胺生理盐水溶液（40mg/kg）。取小鼠骨髓细胞，油镜下每只动物观察1000个嗜多染红细胞，并计算微核率。结果 玻璃陶瓷组、阴性对照组和阳性对照组的微核率分别为（1.31±0.53）‰、（1.32±0.62）‰和（29.20±0.74）‰，玻璃陶瓷组与阴性对照组的差异无统计学意义，与阳性对照组的差异有统计学意义（P<0.01）。结论该新型可切削生物活性玻璃陶瓷不引起小鼠骨髓细胞微核率增加。

玻璃陶瓷；微核实验；致突变性

可切削生物活性玻璃陶瓷，由于可作为计算机辅助设计/计算机辅助制作（CAD/CAM）修复系统的原材料而具有广阔的应用前景，倍受各国学者青睐。东北大学材料研究所近年来开发研制出一种新型的可切削生物活性玻璃陶瓷，该材料具有较低的熔化温度、良好的可切削性能和较高的抗弯强度［1］，预期应用于口腔修复专业，作为CAD/CAM嵌体、冠、前牙固定桥及种植体的原材料。在临床应用前，除必要的机械、理化性能研究外，还需进行生物安全性评估。本文从遗传毒理学角度通过微核试验评价其潜在致突变性，为其临床应用进一步提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

将待检测的可切削生物活性玻璃陶瓷（东北大学材料研究所提供）制成粉末状，经高温、高压消毒后溶于阿拉伯胶，配成混悬液。主要试剂：甲醇（沈阳国药集团化学试剂有限公司），Giemsa储备液（自制），小牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司），pH6.8～6.98磷酸盐缓冲液（自制）。主要仪器：BH2型光学显微镜（Olympus，日本）。

1.2 动物及分组

清洁级N1H纯系小鼠30只（雌雄各半），体质量20～22g，由中国医科大学实验动物中心提供。将小鼠随机等分为3组（每组雌雄各半）：玻璃陶瓷组，以5g/kg的剂量将制备好的生物陶瓷混悬液经口灌胃给药；阴性对照组和阳性对照组分别灌注等体积的阿拉伯胶和环磷酰胺生理盐水溶液（40mg/kg）。

1.3 嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）的染色及计数

24h后处死动物，剪取小鼠胸骨，除去血污和筋肉，剪去每节骨骺端并用小型的止血弯钳挤出骨髓液，在载玻片上点于预先滴好的一小滴血清中，混匀后以推血片方法制成涂片，置于空气干燥或用电吹风微热吹干。将涂好风干的标本玻片放入染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。将固定晾干的涂片用Giemsa应用液（储备液1份、pH6.8～6.98磷酸盐缓冲液10份混合而成）染色10～15min后，迅速取pH6.8～6.89的磷酸盐缓冲液，用滴管冲洗去染色液，置于片架晾干。

采用双盲法阅片，先在低倍镜下观察，选择细胞分布均匀、染色较好的区域，再在油镜下观察。嗜多染红细胞经Giemsa染色后呈淡灰蓝色，微核在胞质中呈深蓝色的圆形或椭圆形，直径相当于细胞直径的1/20～1/5。每只动物观察1000个PCE，并计算微核率。每只小鼠同时观察并计算200个细胞中嗜多染红细胞与正染成熟红细胞的比值，即P/N比值。

1.4 统计学方法

应用统计软件SPSS16.0对3组数据进行处理，各组微核率以±s表示，并采用SNK检验进行组间比较。

2 结果

2.1 各组小鼠PCE的微核率比较

玻璃陶瓷组与阴性对照组比较，小鼠PCE微核率未增加，差异无统计学意义（P>0.05）；但玻璃陶瓷组的PCE微核率明显低于阳性对照组（P<0.01）。见表 1。

2.2 骨髓细胞镜检结果

玻璃陶瓷组与阴性对照组中含有微核的PCE极低，阳性对照组含有微核的PCE数量明显增加（图1）。

3 讨论

根据ISO制定标准，牙科材料在用于人体之前必须完成一系列研究测试，以判断此种材料的生物相容性。微核实验是体内致突变性实验，与染色体畸变实验的吻合率高达88.7%，是一种快速简洁的毒性检测方法，可以代替染色体畸变实验［2］，在检测细胞毒性的同时可检测出断裂剂［3］，被认为是对断裂剂反应的多个终端的检验［4］。在生物细胞研究中，微核实验被用来证明化学物质对染色体的破坏力［5］，是评估染色体破坏的首选方法。因为它在确定染色体丢失和破坏方面可靠，可用于检测生物材料可浸出成分的潜在致突变性［6］，现已成为检测药物、放射线、有毒物质的遗传毒性，反映人体细胞或体外细胞遗传学损伤的一个重要方法［7］。

骨髓细胞微核分析，主要是计算骨髓细胞中嗜多染红细胞的微核出现率，从而判断受试物的致突变性。阴性对照组的微核率一般应低于3‰，太高则应考虑本次试验无效。本研究中阳性对照组灌注环磷酰胺40mg/kg时，微核率一般为22‰～30‰，说明本研究中动物的灵敏度均属正常。材料组的微核率超过阴性对照组的2倍为阳性结果，只要低于阴性对照组的2倍均属阴性结果［8］。本研究中玻璃陶瓷组微核率（1.31±0.53）‰，阴性对照组微核率（1.32±0.62）‰，阳性对照组微核率（29.20±0.74）‰，不仅符合以上评价标准，还可用统计学分析加以确认。研究结果表明，这种新型可切削生物活性玻璃陶瓷不引起小鼠骨髓细胞微核率增加。

此外，微核实验中P/N比值的正常范围为0.6～1.2，P/N比值<0.1表明PCE形成受到严重抑制，P/N比值<0.05表明受试物剂量过大，结果不可靠［9］。本研究中3组的P/N比值均在正常范围内，表明实验结果可靠。为避免假阴性结果的出现，本研究在预实验的基础上，将灌注剂量提高到5g/kg（ISO/TR7405推荐的灌注剂量为1g/kg）。

综上，本研究从遗传毒理学角度探索了新型CAD/CAM材料的生物相容性，为其临床应用提供了理论依据，同时也为新产品开发奠定了基础。

［1］秦小梅，修稚萌，左良，等.低熔可切削生物活性玻璃陶瓷的研究［J］.无机材料学报，2003，18（6）：1158-1162.

［2］Matsushima T，Hayashi M，Matsuoka A，et al.Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line（CHL/IU）［J］.Mutagenesis，1999，14（6）：569-580.

［3］Kovalkovicova N，Sutiakove I，Kacmar P，et al.The importance of lymphocyte micronucleus test for the detection of genotoxic event［J］.Cent Eur JPublic Health，2000，8（4）：221-226.

［4］Kirsch-Volders M，Vanhauwaert A，De Boeck M，et al.Importance of detecting numerical versus structural chromosome aberrations［J］.Mutat Res，2002，504（1-2）：137-148.

［5］Fenech M.Biomarkers of genetic damage for cancer epidemiology［J］.Toxicology，2002，27（181-182）：411-416.

［6］宁丽，薛淼，黄哲玮，等.医用水凝胶PHEMA致突变性的系列实验研究［J］.口腔材料器械杂志，1996，5（3）：109-111.

［7］杜峰涛，李林.细胞微核形成机理探讨［J］.现代检验医学杂志，2007，22（4）：19-22.

［8］陆华，孙皎，黄哲伟，等.微核试验评价强化聚乙烯的潜在致突变性［J］.口腔材料器械杂志，1999，8（2）：68-69.

［9］王心如.毒理学实验方法与技术［M］.北京：人民卫生出版社，2003：70-71.

（编辑 陈 姜，英文编辑 郑华川）

Micronucleus Test of a New Machinable Bioactive Glass-ceramic Material

HAOYu-quan1，YANXiu-lin2，ZHANGYi-xiao3，HANXue-song3，LIUMin-da4，AIHong-jun1

（1.Department of Prosthodontics，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；2.Department of Orthodontics，，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；3.The 94th Class，Faculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Department of Stomatology，Liaoning Province Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Shenyang 110034，China；5.The 93rd Class，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo evaluate the potential mutagenicity of a new machinable bioactive glass-ceramic material.MethodsThirty N1Hmouse inbred line（female：male=1：1）were divided to three groups at random（n=10），including glass-ceramic groups（oral administration of 5g/kg glass-ceramic powder and arabic gum），negative control group（arabic gum in equal volume），and positive control group（oral administration of 40mg/kg cyclophosphamide）.The mice orally intook the equivalent liquor and were sacrificed with bone marrow cells abstracted 24hours later.The micronucleated cells were counted in 1000polychromatic erythrocytes （PCE）per mouse，then the rate of the micronucleus in every group was measured.ResultsThe rate of the micronucleus in glass-ceramic group，negative control group and positive control group was 1.31±0.53‰，1.32±0.62‰ and 29.20±0.74‰ respectively.There was no significant difference in the rate of the micronucleus between the experimental and negative groups （P>0.05），while a significant difference in the rate of the micronucleus was observed between experimental and positive groups（P<0.01）.ConclusionThe new machinable bioactive glass-ceramic materials couldn’t increase the micronucleus rate of mouse bone marrow cells.

glass-ceramic；micronucleus test；mutagenicity

R783.1

A

0258-4646（2010）01-0028-03

辽宁省教育厅高校科研基金资助项目（05L481）

郝玉全（1975-），男，主治医师，博士研究生.

艾红军，E-mail：aih0620@yahoo.com.cn

2009-09-21