田口实验设计法优选黄芪皂苷的提取工艺

赵强强， 韩 丽*， 谢兴亮， 吴品江， 熊永爱， 杨 明，3*

(1.成都中医药大学，中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137;2.成都医学院，四川 成都610083;3.江西中医学院，现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.vat.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。黄芪味甘性温，归肺、脾经。具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效［1］。黄芪含皂苷、黄酮、多糖及氨基酸等多种化学成分，其中皂苷为黄芪的主要活性成分，并以黄芪甲苷为主［2-3］。黄芪甲苷也是目前黄芪药材以及制剂质量控制的常用指标性成分［4］。本实验采用田口实验设计法，以黄芪甲苷提取量为本研究的控制指标，考察提取各因素对提取效率的影响，优化黄芪的提取工艺条件，为工业生产提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器(ELSD100)(美国softa公司生产)，空气压缩机(天津市琛航科技仪器有限公司);LC-10Atvp泵;CTO-10Asvp柱温箱;N2000色谱工作站;StartoriousBP211D电子天平;SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料 黄芪甲苷对照品(批号110781-200613，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供)。试剂:乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。水为重蒸水。本实验所用黄芪购自四川利民中药饮片有限责任公司，经成都中医药大学药学院中药鉴定教研室裴瑾副教授鉴定，为膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，按《中华人民共和国药典》(2005年版)标准鉴定，使用药材符合黄芪药材质量规定。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Welc C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(40∶60);流速:1 mL/min;柱温:30℃;ELSD检测器条件:漂移管温度为80℃，载气(空气)流量为50psi。理论塔板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4 000。

2.1.2 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品5.10 mg，加甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀即得。取对照品溶液，分别进样 8、10、12、16、20、22 μL，以进样量的对数(μg)为横坐标、峰面积的对数为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=1.419 8x+5.347 7，r=0.999 3黄芪甲苷在4.08～11.22 μg范围内呈良好线性。

2.1.3 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录黄芪甲苷峰面积，结果 RSD为1.26%。

2.1.4 稳定性试验 将同一份供试品溶液于室温下放置，分别于第 0、2、4、6、8 h 各进样 10 μL，按上述色谱条件检测，记录黄芪甲苷峰面积值，其RSD为2.18%，表明供试品溶液在室温下放置8 h内稳定。

2.1.5 重复性试验 取同一样品溶液5份，按上述供试品溶液制备方法制备，按照上述色谱条件分别进行测定，记录黄芪甲苷峰面积值，RSD为2.08%。

2.1.6 加样回收率试验 取已知含量的样品溶液(0.113 3 mg/mL)6份，分别精密加入浓度为1.03 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液1.3 mL，按上述供试品溶液制备方法制备，按照上述色谱条件分别进行测定，计算平均回收率为101.62%，RSD为1.88%。结果见表1。

表1 加样回收率试验测定结果

2.1.7 样品测定 将黄芪饮片在50℃烘干，精密称取各约100 g的药材9份，按表2中的条件进行加热回流提取。分别取适量提取液水浴挥干，残渣加10 mL水溶解，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇萃取液，用氨试液萃取2次，每次40 mL，弃去，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，用外标法计算，色谱图见图1、2。

图1 黄芪甲苷对照品色谱图

图2 供试品色谱图

2.2 提取工艺因素水平的确定

根据文献报道及预试验结果，选择乙醇提取，影响乙醇提取的主要因素有乙醇浓度及用量、提取时间及次数，选用L9(3)4正交设计表进行实验。以黄芪甲苷的提取量为评价指标，进行最佳提取工艺的筛选。正交设计表表头设计见表2。

表2 试验因素水平

2.3 结果与分析

2.3.1 实验结果 称取黄芪饮片100 g 9份，按表2中条件进行加热回流提取。分别测定黄芪甲苷的提取量，结果见表3。

2.3.2 田口设计 Taguchi方法根据对试验中质量特性值要求的数值范围不同，分为望目值、望大值和望小值质量特性，其中望大值质量特性是希望质量特性值越大越好，波动的程度越小越好。而在试验中，影响质量特性波动的原因为因素，主要分为可控因素和不可控因素。可控因素主要是能够在试验中人为加以控制的因素，如乙醇浓度及用量、提取时间及次数等;不可控因素主要是在试验中事先设定或较难控制的因素，如标示因素、误差因素等。本实验主要关注可控影响因素对黄芪甲苷提取量的影响。

Taguchi方法能够充分利用系统中存在的非线性效应，通过选取适当的正交设计表安排试验，然后通过对试验结果进行信噪比分析和方差分析确定各因素的最优条件以及影响显著性程度。本实验选用L9(3)4正交设计表进行实验，结果见表3，在表3中，S/N为信噪比值，信噪比计算公式如下:

公式中，yi为黄芪甲苷提取量，yexp为预测黄芪甲苷提取量，本实验取望大值，即S/N数值越大越好。

表3 田口实验数据计算

由于Taguchi方法中，S/N值最大的水平为最优水平，因此通过算术平均方法求出各个因素在不同水平上的平均S/N值，并以图的形式给出了各因素随不同水平的变化趋势(见图3)。由图3可知，A因素(乙醇浓度)的3号水平，B因素(乙醇用量)的3号水平，C因素(提取时间)的3号水平，D因素(提取次数)的3号水平为各因素的最佳水平。

图3 各因素在不同水平的S/N变化趋势图

通过S/N值方差分析考察了各因素对黄芪甲苷提取量影响的显著性，方法分析结果见表4，F值是各因素影响显著性的重要指标，F值越大，说明该因素影响越显著，此外，纯平方和在总平方和中所占的比率称为贡献率，也可用来估计各因素的影响显著性程度。由表4可见，因素D提取次数影响最显著，因素A乙醇浓度、B乙醇用量、和C提取时间影响较小，即黄芪甲苷的提取量受提取次数影响远大于其他因素。

表4 方差分析

通过平均S/N值，结合方差分析结果，考虑到工业生产成本及安全性等问题，故选A、B、C三因素的1号水平，D因素的3号水平。采用design expert7.1软件A1B1C1D3预测了各因素在上述最优水平条件下信噪比值S/N为-1.794 4，将此值带入S/N计算公式，可以得出黄芪甲苷提取量的最佳预测值为0.81 mg/g。

2.4 验证实验

由于所选方案是正交表中没有的方案，故尚需做实验予以验证。取与上述正交实验同批次的黄芪饮片250 g，共3份，按方案A1B1C1D3进行提取，其余操作同前，结果见表5，与预测结果比较，差别不大，结果较为满意。

表5 验证试验结果

3 讨论

3.1 田口试验设计是利用正交表挑选试验条件、安排试验的方法。其设计过程分3个阶段，即:系统设计、参数设计和容差设计。其中重点是参数设计，而参数设计的重点是稳定性设计。常采用信噪比(S/N)作为衡量稳定性好坏的指标。

该试验设计方法的优点是成功地运用以信噪比作为质量评价指标，以寻求最优的稳定性好的参数组合［5］，并能实验最佳组合进行预测。

3.2 由于黄芪甲苷仅在200 nm左右有微弱的末端吸收，采用紫外检测器进行检测干扰大，灵敏度低，而蒸发光散射检测器(ELSD)对无紫外吸收的化合物具有较高的检测灵敏度，因此选用HPLC-ELSD对黄芪甲苷进行含量测定。

［1］中国药典［S］.一部.2005:212.

［2］Xiao Hongbin，Liang Xinmiao，Lu Peichang.Total analytical method for Radix astragali extract usingtwo-binarymulti-segment gradient elution liquid chromatography［J］.J Separa Sci，2001，24(3):186-196.

［3］Xiao H B，Krucker M，Putzbach K，et al.Capillary liquid chromatography-microcoil H-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy and liquid chromatography-ion trap mass spectrometry for on-line structure elucidation of isoflavones in Radix astragali［J］.J Chromatogr，2002(1):135-143.

［4］夏广萍，刘 鹏，韩英梅.不同处理方法和不同产地黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定［J］.中药材，2008，31(3):386.

［5］施月芹，练富林，胡育筑.田口方法及其在药学相关领域的应用［J］.药学进展，2008，32(8):363.