了哥王中芫花素的提取分离与含量测定

刘丽霞， 赵 挺， 陈 扬， 孙立新*

(1.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016;2.辽宁省药物研究院，辽宁沈阳110016)

了哥王是瑞香科荛花属植物Wikstroemia indica(L.)C.A.Mey的根茎，其性苦味寒、微辛、有毒，具有消肿止痛、清热解毒、化痰散结等作用，临床应用于肺热咳喘、咽喉肿痛、跌打损伤等，疗效较好，对肝炎、肝硬化、肾炎等有一定作用［1］，陈扬［2］等进行药理研究证实了哥王具显著抗肿瘤活性。了哥王药材化学成分复杂，文献报道主要为香豆素类、黄酮类、木脂素类、皂苷等，其中黄酮类成分有抗菌、抗炎、镇痛等作用［3-4］。芫花素为黄酮类化合物，目前有关了哥王药材中芫花素的含量测定未见报道，本实验从药材中分离得到芫花素并采用高效液相色谱法对其进行含量测定，为了哥王药材质量标准的建立提供依据。

1 仪器与材料

依利特高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)，UV2000Ⅱ紫外可变波长检测器(大连依利特分析仪器有限公司)，N3000色谱工作站，QE100药材粉碎机(浙江省武义县屹立工具有限公司)，KQ-100型超声仪(昆山市超声波仪器有限公司)，TG332A分析天平(湘仪天平仪器厂)。

对照品:芫花素(本实验室自制，HPLC法测得纯度质量分数大于99.0%)，甲醇、乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂)，水(娃哈哈饮用纯净水)，其余试剂(分析纯，市售)。

了哥王药材9批，均为市售品，由沈阳药科大学孙启时教授鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王［Wikstroemia indica(L.)C.A.Mey.］。

2 方法与结果

2.1 芫花素的分离与鉴定

了哥王药材，粉碎，加入10倍量95%乙醇，回流提取3次，1.5 h/次，合并提取液并浓缩，回收溶剂，所得浸膏用适量水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得相应萃取物浸膏。将了哥王乙酸乙酯萃取物(146 g)干浸膏与约2倍量的硅胶拌样，上样于硅胶柱，氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)梯度洗脱，共合并收集16个流分。将流分2再经硅胶柱层析，环己烷-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脱，在环己烷-丙酮(20∶1)洗脱液中有黄色结晶析出，收集结晶，再经重结晶，干燥，即得芫花素(25 mg)。

样品的1H-NMR谱数据如下1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:3.84(3 H，s，-OCH3)，6.34(1 H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.72(1 H，d，J=2.0 Hz ，H-8)，6.80(1 H，s，H-3)，6.93(2 H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，7.94(2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，10.34(1 H，s，4′-OH)，12.93(1 H，s，5-OH);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ:181.7(C-4)，165.0(C-7)，163.8(C-2)，161.0(C-9)，159.8(C-4′)，157.0(C-5)，128.3(C-2′，6′)，121.0(C-1′)，115.7(C-3′，5′)，109.5(C-5)，104.4(C-10)，103.0(C-3)，97.9(C-6)，92.6(C-8)，56.0(-OCH3)。该化合物光谱数据与文献［5］报道的芫花素光谱数据基本一致，故鉴定该化合物为芫花素(genkwanin)，化学结构如图1所示。

图1 芫花素结构式

2.2 HPLC法测定芫花素的含量

2.2.1 色谱条件

色谱柱:依利特-C18柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-水-冰乙酸(65 ∶35 ∶2，v/v);检测波长:332 nm;柱温:40 ℃;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL。

2.2.2 对照溶液的制备

精密称取芫花素对照品约5 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，即得200.0 μg/mL的芫花素对照品贮备液。

2.2.3 供试溶液的制备

取了哥王干燥药材细粉(过60目筛)约3 g，精密称定。加90%乙醇90 mL浸泡12 h后，超声提取3次，每次0.5 h。过滤，合并滤液，减压蒸干，所得浸膏用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜得续滤液，即为供试溶液。

2.2.4 色谱系统适用性试验

在2.2.1项色谱条件下，理论板数按芫花素计，不低于6 000。芫花素与相邻组分峰的分离度及其拖尾因子均符合要求。色谱图见图2。

2.2.5 线性关系考察

精密量取芫花素对照品贮备液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL至25 mL量瓶中定容，制成芫花素系列对照溶液，质量浓度分别为0.8、1.6、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL。上述系列溶液各进样20 μL，以对照溶液的质量浓度(C，μg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，芫花素A=1.480×104C-4.012×103，相关系数r=0.999 8。结果表明芫花素质量浓度在0.8～32 μg/mL内与峰面积的线性关系良好。

2.2.6 精密度试验

精密吸取芫花素(8.0 μg/mL)对照溶液 20 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，计算芫花素峰面积的RSD为2.2%，表明仪器精密度良好。

图2 了哥王药材HPLC图谱

2.2.7 稳定性试验

取供试品溶液(NO.4)，室温放置，分别于 0、2、4、8、12、16、24 h进样20 μL，记录色谱峰面积。计算芫花素峰面积的RSD为4.1%。结果表明供试品溶液在室温下24 h内较稳定。

2.2.8 重复性试验

称取同一了哥王干燥药材细粉(NO.6)约3 g，精密称定，按供试溶液制备方法，平行制备6份供试溶液，进样20 μL，根据芫花素色谱峰面积，计算芫花素含量的平均值为28.37 μg/g，RSD为3.4%。结果表明方法的重复性良好。

2.2.9 回收率试验

精密称取已知含量的了哥王干燥药材细粉(NO.4)约1.5 g(芫花素含量为28.37μg/g)，共9份，分别加入低、中、高3个质量浓度的对照品溶液(分别相当于药材原有含量的50%、100%、150%)，每浓度3份，按供试溶液制备方法制备供试液，分别测定，计算含量，芫花素的平均回收率为99.8%，RSD为2.1%(n=9)，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.2.10 样品测定

精密称取9个产地的了哥王干燥药材细粉3.0 g，按供试溶液制备方法制备供试溶液，进样分析后，计算芫花素的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 HPLC分离分析条件的选择 比较甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸洗脱系统作为流动相，二者对色谱峰的分离无明显差异，故选择经济的甲醇系统，比较了磷酸、冰醋酸等酸改性剂，都抑制了峰形的拖尾现象，但冰醋酸的改善峰形的效果较好。调整流动相比例，选用甲醇-水-冰醋酸(65∶35∶2，v/v)时，样品中待测成分分离效果较好。

表2 不同产地了哥王药材中芫花素含量(n=3)

3.2 了哥王中芫花素提取条件的优化 比较了回流提取法和超声提取法，结果回流提取3次，每次2 h与超声提取3次，每次0.5 h，二者提取含量接近，因此采用方便省时的超声提取法。比较了甲醇、无水乙醇作提取溶剂，二者提取率相近，故选用毒性小的无水乙醇，又比较了体积分数为50%、70%、90%乙醇，选择提取率高的90%乙醇。

3.3 实验结果表明，不同产地了哥王中芫花素含量差别明显，其中江西和广东产地的了哥王中芫花素含量较高，而贵州、广西和桂林产地的偏低，可能与药材产地的地理环境差异有关，东南地区的产量较高，西南地区产量偏低。

［1］朱亚敏，胡敏灿.了哥王的药理研究和临床应用［J］.浙江中医杂志，2004，(1):42-43.

［2］陈 扬，李艳春，马恩龙，等.了哥王抗肿瘤活性部位筛选［J］.中华中医药学刊，2008，26(11):2520-2521.

［3］谢宗万主编.全国中草药汇编(上册)［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，1996.

［4］罗献瑞主编.实用中草药彩色图集［M］.第2版.广州:广东科技出版社，2000.

［5］耿立冬，张 村，肖永庆.了哥王中的1个新双香豆素［J］.中国中药杂志，2006，31(1):43-44.