HPLC法测定黄连及炮制品中4种生物碱的含量

刘 峰， 张振秋， 赖静怡， 胡 北

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600)

黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)或云连(Coptis teeta Wall.)的干燥根茎，主要分布于我国四川、云南、湖北等地。其味苦，性寒。归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒功效［1］。黄连药材所含的生物碱主要有小檗碱(berberine)、巴马汀(pamatine)、黄连碱(coptisine)、药根碱(jatrorrhizine)等小檗碱型生物碱［2-3］，本实验采用HPLC法对10个不同来源黄连药材及8种不同炮制品样品进行分析，旨在对黄连生品和炮制品进行质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、在线脱气机、VWD检测器;AS3120A超声提取器;2140型电子分析天平、METTLER AB135-S十万分之一电子天平(瑞士);U-3010型紫外-可见分光光度计、HH-4数显恒温水浴锅。

1.2 试药

盐酸黄连碱对照品、盐酸巴马汀对照品由上海顺勃生物工程技术有限公司提供，盐酸药根碱对照品(批号:110733-200806)、盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200804)均购于中国药品生物制品检定所。本研究收集了10种不同来源的黄连药材(见表1)，经辽宁中医药大学李峰教授鉴定均为正品药材。黄连炮制品均由四川购进的同一批黄连药材(8号)，参照《中国药典》、《中药炮制学》、《中药炮制学辞典》中黄连的不同炮制方法依法自制［1，4-5］，分别得到酒制、醋制、萸制、盐制、姜制、胆制、土制和碳制等不同黄连炮制品。乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。其它试剂均为分析纯。

表1 样品的来源及收集时间

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomoil-C18BDS(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(45 ∶55，内含磷酸二氢钾0.34 g，十二烷基硫酸钠0.17 g);检测波长:345 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取盐酸小檗碱，盐酸巴马汀，盐酸黄连碱，盐酸药根碱对照品适量，加甲醇-盐酸(100∶1)溶解，制成浓度分别为0.160 0 mg/mL、0.202 0 mg/mL、0.153 6 mg/mL、0.244 4 mg/mL 的对照品贮备液，备用。精密吸取盐酸小檗碱对照品贮备液7.3 mL，盐酸巴马汀对照品贮备液1.1 mL，盐酸黄连碱对照品贮备液0.9 mL，盐酸药根碱对照品贮备液0.6 mL，置同一棕色10 mL量瓶中，加甲醇-盐酸(100∶1)稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取不同来源及不同炮制品黄连药材(过20目筛)0.1 g至具塞锥形瓶中，加入甲醇—盐酸(100 ∶1)100 mL，称重，超声 1 h，取出放至室温，用甲醇-盐酸(100∶1)补足损失的重量，滤过取续滤液，作为供试品溶液，备用。

2.4 系统适用性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液，注入HPLC色谱仪，记录色谱图，在选定的色谱条件下盐酸小檗碱，盐酸巴马汀，盐酸黄连碱和盐酸药根碱的理论塔板数均不少于10 000，与其他峰的分离度均大于1.5。见图1。

图1 混合对照品(A)和样品(B)HPLC谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备 精密吸取2.2项下的混合对照品溶液 2、4、6、8、10 μL 注入高效液相色谱仪，测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。

表2 标准曲线结果表

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(8号药材)连续进样6次，记录色谱峰面积，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸药根碱峰面积的RSD值分别为1.3%、1.2%、1.4%、1.8%。结果表明，仪器精密度较好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(8号药材)在0、2、4、8、10、12 h 分别进样分析，记录色谱峰面积，结果盐酸小檗碱，盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸药根碱峰面积的RSD值分别为2.3%、2.4%、2.5%和2.1%。结果表明，供试品在本实验条件下稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取黄连药材(8号药材)5份，每份约0.1 g，按2.3项方法制备，并进样分析，记录色谱峰面积，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸药根碱峰面积的RSD值分别为2.1%、2.6%、2.8%和1.9%。结果表明，本方法重复性较好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知盐酸小檗碱(45.40 mg/g)、盐酸巴马汀(13.86 mg/g)、盐酸黄连碱(20.71 mg/g)和盐酸药根碱(4.53 mg/g)含量的药材(8号药材)5份，每份约0.05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸小檗碱对照品贮备液14.19 mL(0.160 0 mg/mL)、盐酸巴马汀对照品3.43 mL(0.202 0 mg/mL)、盐酸黄连碱对照品6.74 mL(0.153 6 mg/mL)、盐酸药根碱对照品0.93 mL(0.244 4 mg/mL)于具塞锥形瓶中，按2.3项下方法制备供试品溶液并进样分析，结果盐酸小檗碱的平均回收率为100.5%，RSD为2.5%;盐酸巴马汀的平均回收率为100.7%，RSD为2.7%;盐酸黄连碱的平均回收率为100.7%，RSD为2.7%;盐酸药根碱的平均回收率为102.6%，RSD为2.4%。

2.6 不同来源黄连药材及不同炮制品的含量测定

分别取不同来源黄连药材及不同炮制品，按2.3项下方法制备，精密吸取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL、10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，采用外标二点法计算盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸药根碱的含量，结果见表3、4。

3 讨论

3.1 从表3可以看出10个不同来源的黄连药材(味连)四种指标性成分含量差别较大，盐酸小檗碱的含量从45.40～29.84 mg/g;盐酸黄连碱的含量从20.71～10.29 mg/g;盐酸巴马汀的含量从14.57～7.85 mg/g;盐酸药根碱的含量从4.95～2.55 mg/g。从生物碱的总量来看，四川的黄连药材总含量最高，南京药材总含量最低。

表3 不同来源黄连药材中4种生物碱的含量测定结果表(n=3)

表4 不同炮制品及生品(8号)中4种生物碱的含量测定结果表(n=3)

3.2 本实验首次测定了黄连8种不同炮制品的4种生物碱含量，从表4可以看出8种不同炮制品的4种指标性成分的含量有一定差异，所测定不同炮制品的生物碱含量顺序为:酒制＞醋制＞姜制＞萸制＞土制＞胆制＞盐制＞碳制，结果显示用不同辅料炮制后，生物碱的浸出率不一样，酒制和醋制的浸出率较高。

3.3 表4中生品(8号)与不同炮制品对比可以看出，黄连炮制前后生物碱含量有差异。结果显示炮制对其有所影响;不同炮制品中4种生物碱的含量也有一定差异，它提示根据中医药理论及辩证论治法则，选用不同炮制品的黄连配伍处方入药，为不同的制剂及临床用药提供了依据。

［1］中国药典［S］.一部.2005:141.

［2］Zhou Yuanyao，Chen Yanxiang，Zhu Bin，et al.Optimization of HPLC conditions for 15 naturally occurring protobererine type quaternary alkaloids［J］.Acia Pharm Sin，1988，23(12):938.

［3］晁若冰，张 浩，庄燕黎，等.高效液相色谱法测定黄连药材中小檗碱型生物碱的含量［J］.药物分析杂志，2003，23(5):354-357.

［4］叶定江，张世臣，潘三红.中药炮制学［M］.北京:中国中医药出版社，1999:216.

［5］叶定江，原思通.中药炮制学辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，2005:6.