左金丸及类方的体外溶出行为研究

程丹红， 赵艳玲， 杨宏博， 王伽伯 贾 雷， 肖小河

(1.解放军中药研究所解放军302医院，北京100039;2.成都中医药大学，四川成都610015;3.昆明理工大学，云南昆明650224)

左金丸载于《丹溪心法》，由黄连6两，吴茱萸1两组成，清泻肝火，降逆止呕。主治胃热证;甘露散载于《圣济总录·中喝门》，由黄连一两，吴茱萸半两组成，主治暑气证;茱萸丸载于《太平圣惠方·治水泻诸方》，由黄连2两，吴茱萸2两组成，主治虚寒下痢水泻［1，2］;反左金丸出自《施今墨药对》，由黄连1两，吴茱萸6两组成，主治胃寒证［3］。这4个复方仅仅由于用药比例的不同，而主治病证相差甚异。其类方“形似而神不同”的特征，体现了中医组方的精妙之处。目前，对左金丸及其类方的研究，主要以化学成分分析以及药理研究为主［4-6］，孔维军［3］等人对左金丸及其类方的药性进行了研究，从寒热药性角度研究了类方之间的差异。作者则以主要活性成分小檗碱、药根碱、巴马汀作为检测指标，通过模拟体内胃肠道溶出环境，对左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸的体外溶出行为进行研究，比较类方在胃肠道的溶出规律，验证左金丸及类方的客观差异性，为中医经典类方的研究提供参考和依据。

1 仪器与试药

ACQUITYTM超高效液相色谱仪(Waters公司)包括在线真空脱气系统，四元泵，自动进样器，DAD检测器;KQ-500B型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);AL 204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);DFT-200粉碎机(温岭市林大机械有限公司);ZRS-8G溶出度仪(天津大学无线电厂)等。

盐酸小檗碱(批号:11073-200609)、盐酸药根碱(批号:0733-200005)、盐酸巴马汀(批号:110732-200506)购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯(Fisher Scientific U.S.A)，试验用水为Milli.Q超纯水，其他试剂均为分析纯。

黄连与吴茱萸均购于北京同仁堂药房，经中国人民解放军302医院全军中药研究所肖小河研究员鉴定;黄连为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.的干燥根茎;吴茱萸为芸香科植物Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果实。

人工胃液(按中华人民共和国药典2005版配制):量取稀盐酸16.4 mL加水约800 mL，加胃蛋白酶10 g摇匀后加水稀释成1 000 mL。

人工肠液(按中华人民共和国药典2005版配制):取磷酸二氢钾6.8 g加水500 mL使溶解，用0.4%氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另取胰蛋白酶10 g加水适量溶解，将两液混合后加水稀释成1 000 mL。

2 方法与结果

2.1 左金丸及类方中3种生物碱测定方法的建立

2.1.1 标准品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱、药根碱、巴马汀对照品适量，置于50 mL量瓶中，加入一定量的甲醇超声30 min，甲醇定容，即得浓度依次为 18.4 μg/mL、11.6 μg/mL、12.8 μg/mL 的对照品溶液。

2.1.2 样品的制备 称取一定量的黄连细粉、吴茱萸细粉，按相应的比例:左金丸(黄连/吴茱萸6∶1)、甘露散(黄连/吴茱萸2∶1)、茱萸丸(黄连/吴茱萸1∶1)、反左金丸(黄连/吴茱萸1∶6)均匀混合，即可得所需样品。

2.1.3 供试品溶液的制备 取不同时间溶出介质溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.4 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm);

流动相组成为:流动相A为乙腈，流动相B为0.05%的H3PO4水。进行梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。柱温为22.5℃，检测波长347 nm，进样量为0.2 μL，全自动进样。见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 左金丸及类方样品和混合对照品溶液的UPLC图谱

2.1.5 线性关系 精密量取各对照品溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀即可。吸取一定量的对照品溶液经过0.22 μm滤膜过滤，置于样品瓶中，自动进样，进样量0.2 μL。测定峰面积。以各对照品溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。小檗碱:Y=9×106X+9 735.2，r=0.999 8，巴马汀:Y=1×107X+5 851.4，r=0.999 2，药根碱:Y=2 ×107X+8 740.4，r=1.000。结果表明小檗碱在9.2～147.2 μg/mL，巴马汀在6.4 ～102.4 μg/mL，药根碱在 5.8～92.8 μg/mL时，与峰面积呈现良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按上述条件连续测定5次，记录峰面积值，结果RSD值为1.8%，表明精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取左金丸及类方供试品溶液，分别在 0、2、4、8、16、24 h 测定。结果表明:供试品溶液在24 h内基本稳定，RSD为2.2%。

2.2 左金丸及类方体外溶出试验

2.2.1 溶出介质的选择 将已经混合均匀的左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸药材细粉，置于溶出杯中，分别在以下4种不同的溶出介质(pH=1.2的稀盐酸溶液、pH=6.8的KH2PO4溶液、人工胃液、人工肠液)中进行。将所得样品溶液在上述色谱条件下进行测定，记录左金丸及其类方中小檗碱、药根碱、巴马汀的峰面积，计算溶出量。结果表明:不同的溶出介质对左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中的3种生物碱的溶出影响较大。各复方中3种生物碱溶出量大小顺序依次为:pH=1.2的盐酸溶液>人工胃液>人工肠液>pH=6.8 KH2PO4溶液。依据溶出介质选择的标准，将pH=1.2的盐酸溶液作为左金丸及类方的体外溶出介质。

2.2.2 左金丸及类方最大溶出量的测定 参照中国药典2005年版二部附录ⅩC第三法(小杯法)，分别精密称取左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸0.7 g、0.6 g、0.6 g、0.7 g，置于溶出测试仪中，加 250 mL已脱气的pH=1.2的盐酸溶液作为溶出介质，恒温(37±0.5)℃，转速为100 r/min，溶出3 h后，取样5 mL，离心取上清液并用0.22 μm滤膜过滤，滤液置于样品瓶中，在上述色谱条件下进行测定，计算最大溶出量。结果见表2、3、4。

表2 左金丸及类方中小檗碱体外溶出量

表3 左金丸及类方中巴马汀体外溶出量

表4 左金丸及类方中药根碱体外溶出量

结果表明:左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗碱、巴马汀、药根碱在pH=1.2的盐酸溶液中3 h的溶出量存在显著差异。其中左金丸中3种生物碱的溶出量最多，依次为甘露散、茱萸丸、反左金丸。随着类方配伍中黄连剂量的减少，吴茱萸剂量的增加，类方中3种生物碱的溶出量不断减少，但黄连和吴茱萸主要生物碱的每克溶出率并没有呈相同比例的减少或增加。可能是由于两药配伍后生物碱成分相互作用形成新的化学物质或吴茱萸中某些成分影响了黄连中生物碱的溶出。

2.2.3 左金丸及类方溶出速度的测定 分别精密称取左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸0.7 g、0.6 g、0.6 g、0.7 g，置于溶出测试仪中，加 250 mL 已脱气处理的pH=1.2的HCl溶液作为溶出介质，采用浆法，恒温(37 ±0.5)℃，转速为100 r/min，分别在1、2、3、4、5、10、30、45、60 min 时吸取溶液 5 mL(随即补加同体积同温介质)，离心，取上清液用0.22 μm滤膜滤过，滤液置于样品瓶中，在上述色谱条件下测定峰面积，计算不同时间各复方中小檗碱、巴马汀、药根碱的溶出量。结果见表5、6、7。

表5 左金丸及类方中小檗碱体外溶出速度

表6 左金丸及类方中巴马汀的体外溶出速度

结果表明:左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗碱、巴马汀、药根碱的溶出非常快速，在5 min内即可达到最大溶出速度。其中左金丸中3种生物碱都在2 min时达到最大溶出速度;甘露散与茱萸丸中的小檗碱和巴马汀均在4 min时达到最大溶出速度，而反左金丸中的小檗碱和巴马汀则在3 min时溶出速度最大。同时作者发现，随着时间的延长，3种生物碱的溶出量逐渐减小，原因可能是由于吴茱萸中的某些成分影响了黄连中生物碱的溶出或者是生物碱自身结构发生了分解，转化成其他的化合物或不溶物［7-9］。对于真正的原因还需要进一步进行实验研究。

表7 左金丸及类方中药根碱体外溶出速度

3 讨论

3.1 本实验利用超高效液相色谱(UPLC)建立了左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗碱、巴马汀、药根碱的测定方法。所建立的方法重现性好，精密度、准确度高;与HPLC相比，可以有效的节约出峰时间和溶剂消耗。

3.2 通过对四个复方溶出介质的选择，作者发现不同的溶出介质对小檗碱、巴马汀、药根碱的溶出影响较大。其中在pH=1.2的HCl溶液中，3种生物碱的溶出量较多，而在pH=6.8的KH2PO4溶液中，溶出则最少。

3.3 由于中药的疗效与其活性成分的溶出密切相关，各种活性成分的溶出是否具有同步性，直接影响到各成分之间的相互作用以及与机体的作用，最终影响该复方或单味中药的药效。因此左金丸及其类方主治病证差异的原因可能与活性成分的溶出有关。从溶出量来看，左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中的小檗碱、巴马汀、药根碱经过溶出3 h后，最大溶出量存在显著差异。其中甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗碱的溶出量仅为左金丸的78.88%、56.62%、11.18%;类方中3种生物碱的溶出速度也不尽相同，但差异很小，均在5min内达到最大溶出。通过对实验结果分析，作者发现随着黄连比例的减少吴茱萸的增加，含吴茱萸比例较多的类方，这3种生物碱的溶出明显减少，但并没有按相同比例的减少。可能是由于吴茱萸中的某些成分影响了黄连中生物碱的溶出，或者是两味药中的某些成分相互作用，产生了新物质。另外，作者发现含有吴茱萸较多的类方，在放入溶出介质后，由于吴茱萸为干燥的近成熟的果实，质地较轻而易发生结块，这可能也是影响黄连中生物碱溶出的一个原因。

3.4 通过模拟体内胃肠道环境，以活性成分小檗碱、巴马汀、药根碱为检测指标，研究左金丸及类方在胃肠道的溶出规律，验证了类方之间主要活性成分溶出行为的客观差异性，对其“形似而神不同”的本质进行了初步的研究，在以后的研究中还需对类方中活性成分的吸收以及代谢等体内过程进行更深入的研究，以此了解类方发挥药效的作用机制。

［1］叶富强，徐颂芬，陈蔚文，等.黄连与吴茱萸配伍比例对黄连生物碱含量的影响［J］.河北中医，2000，22(5):397.

［2］黄兆胜，李盛青，何丽春，等.黄连与吴茱萸的不同比例配伍对大鼠红细胞膜ATP酶活性的影响［J］.中药药理与临床，2001，17(5):1-2.

［3］孔维军，赵艳玲，山丽梅，等.左金丸及类方药性差异的生物热动力学研究［J］.中成药，2008，30(12):1762-1766.

［4］李盛青，黄兆盛，黄耀权，等.黄连与吴茱萸不同比例组成的方剂的不同药理作用研究［J］.广州中医药大学学报，2002，19(2):48-50.

［5］朱妙琴.反相高效液相色潽法同时测定黄连、左金丸及反左金丸中三种生物碱的含量［J］.分析试验室，2007，26(13):144-146.

［6］陈艳芬，陈蔚文，李茹柳，等.“左金丸”与“反左金丸”的药效学反应比较研究［J］.中国中医基础医学杂志，2002，8(10):67-69.

［7］彭明兴，吴永江，程翼宇.黄连与吴茱萸配伍时黄连中主要化学组分溶出率变化规律研究［J］.中国中药杂志，2003，28(7):629-631.

［8］潘浪胜，徐晓梅，吕秀阳，等.黄连与吴茱萸分煎后配伍时主要组分含量变化规律研究［J］.中国药学杂志，2005，40(4):258-26.

［9］王浴铭，张君增，朱风云，等.黄连配伍吴茱萸对黄连中主要化学成分的影响［J］.中国中药杂志，1994，19(2):115.