卵磷脂对胎儿生长受限模型子鼠学习记忆力的影响

李巍巍，任丽娜

(中国医科大学 附属第一医院 产科，辽宁 沈阳 110001)

胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)发病率占妊娠的2．75%～15．53%不等，中国的发病率平均为6．39%[1],是围生期的重要并发症之一。Alberry等[2]经过6年的随访追踪发现，FGR患儿的生长参数、神经发育评分及智商等均显著低于对照组。因此预防和减少FGR的发生有重要意义，目前孕期营养不良与FGR的关系已越来越受到关注，除热能和蛋白质不足外，维生素营养不足，如维生素A、维生素E、维生素B、叶酸等不足对胎儿宫内生长的不良影响正逐渐引起人们的注意[3]。母体的健康与治疗对FGR影响非常大，及时处理可改善FGR的预后[4]。卵磷脂具有增强组织和细胞结构，增强人体生理机能，改善脂肪代谢等功效[5]。本研究通过慢性宫内乏氧模型探讨卵磷脂摄入促进FGR子鼠神经发育的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 大鼠FGR模型制备：无交配史大白鼠20只(由中国医科大学实验动物部提供)受孕后随机分为两组：(1)对照组10只于妊娠第17天行腹部开关术；(2)FGR组10只于妊娠第17天行经腹子宫动脉缩窄术。其余处理两组相同，妊娠21～23 d分娩为足期分娩，其子鼠为本研究对象。

1.1.2 FGR子鼠判断标准:用电子天平为子鼠称重，精确到0.01 g,以低于对照组子鼠平均体重2个标准差为FGR判断标准，并且废除FGR组中不符合FGR诊断标准的子鼠，本实验中子鼠均为FGR子鼠。

1.1.3 实验分组：将筛选出的FGR子鼠随机分为两组,实验组与对照组各10只。两组均以标准小鼠颗粒饲料喂养，实验组子鼠额外灌食卵磷脂100 mg/d[6]。

1.2 学习记忆能力检测

1.2.1 Morris水迷宫实验：Morris水迷宫为一不锈钢的圆形水池，内壁黑色，直径100 cm，高50 cm，水温控制在(22±1)℃。水池等分为4个象限，任选其中1个象限，正中放置1个安全平台。平台为圆形，直径10 cm，没于水下1 cm。水池放在一间小屋的中央，室内的门、窗、摄像头等构成视觉暗示。迷宫上方安有摄像机，并和计算机连接，自动录入小鼠游泳轨迹并进行分析。历时5 d，上下午各1 次/d，入池位置为平台所邻2个象限的池壁中点。将小鼠面向池壁分别从入水点放入水中，记录其在100 s内寻找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果小鼠100 s未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，停留10 s，逃避潜伏期记成100 s。以2次/d潜伏期算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。

1.2.2 探索试验：撤除平台，任选1个入水点将小鼠放入水中，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中平台，记录其100 s游泳轨迹，计算其在原平台象限游泳时间和穿越原平台次数。

1.3 神经元原位凋亡检测

水迷宫、探索试验后将实验组子鼠及对照组子鼠断头取脑，称重，4%多聚甲醛固定24 h。从海马平面作厚约2 mm冠状切片，常规石蜡包埋切片。采用末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记法(Tdt-mediated dUTP nick end labeling TUNEL)。试剂盒购自瑞士Rocher 公司，参照说明书操作。结果判断：阳性细胞为棕黄色。每个部位计数左右各3个高倍镜(×400)视野下阳性细胞数，取平均值。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠隐蔽平台实验结果比较

隐蔽平台实验从第1天起，实验组的逃避潜伏期即明显短于对照组(P<0．01)，见表1。

表1 各组小鼠隐蔽平台实验逃避潜伏期的比较Tab 1 Time to find platform in 2 groups (n=10)

2.2 各组小鼠探索实验结果比较

撤除平台后，观察小鼠的空间探索能力，发现实验组轨迹大部分位于原平台象限，其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找。对照组基本围绕池壁游泳，其运动轨迹呈随机分布于各象限之中。由表2可以看出实验组的停留原平台象限时间和穿越原平台次数均明显多于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 各组小鼠探索实验的结果比较Tab 2 Result of Passive avoidance test in 2 groups (n=10)

1)与对照组比较，P<0.01

2.3 子鼠神经元原位凋亡检测

实验组子鼠皮层神经细胞的凋亡率平均为(2.2±0.58)个/HP,对照组为(5.08±1.21)个/HP，两组差异有显著性意义(P<0.01)；海马CA1区神经细胞凋亡率：实验组平均为(0.59±0.23)个/HP，对照组为(1.71±0.63)个/HP，两组差异有显著性意义(P<0.01)。见表3。

表3 两组子鼠皮层及海马CAI区神经细胞凋亡率比较Tab 3 Neuronal apoptosis in cortex and hippocampus in 2 groups (个/HP)

1)与对照组比较，P<0.01

3 讨 论

3.1 FGR与神经系统发育

FGR是指任何原因胎儿在宫内生长速度受限，体重低于该孕周标准值第10百分位数以下。发生率约2.75%～15.53%[7]。迄今为止胎儿生长受限的病因尚未完全阐明，目前认为它是多种因素作用的结果，其病因学包括环境因素和遗传因素。最直接的原因是胎盘发育异常和循环功能障碍。研究表明，FGR患者的胎盘血管床阻力增加，导致胎盘胎儿血流灌注量减少，限制营养物质摄取和转运，胎儿生长受限，甚至导致新生儿神经系统发育迟滞。据报道，FGR新生儿神经功能异常发生率为32%[8]。因此推测FGR胎儿神经系统损伤可能与胎盘功能不全导致的慢性宫内缺血缺氧有关。本研究通过结扎子宫动脉制造缺血性FGR模型，通过水迷宫实验等探讨子鼠学习记忆力，以及通过摄取富含磷脂酰胆碱的卵磷脂，探讨改善FGR子鼠神经系统损伤的可能性。

学习记忆是大脑的高级神经生理活动。水迷宫是英国心理学家Morrisr于20世纪80年代初设计的[9]。大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息(外部线索)形成的，近年来已发展成为广泛应用的标准的空间学习记忆检测方法[10]。定位航行试验潜伏期的长短反映动物空间记忆的获得情况，即学习能力。空间探索试验主要反映动物的记忆能力和空间定位能力。而检测药物干预后动物的学习记忆能力是判断药物疗效的重要指标之一。本研究显示，通过摄入卵磷脂，实验组子鼠皮层神经细胞的凋亡率平均为(2.2±0.58)个/HP,对照组为(5.08±1.21)个/HP；海马CA1区神经细胞凋亡率：实验组平均为(0.59±0.23)个/HP,对照组为(1.71±0.63)个/HP，实验组与对照组比较，皮层及海马CA1区神经细胞凋亡差异有显著性意义(P<0.01)，实验组子鼠空间学习记忆能力较对照组明显上升(P<0.01)。海马区与学习记忆功能密切相关，FGR子鼠皮层、海马神经元凋亡率明显高于正常FGR子鼠，本研究显示摄入卵磷脂有助于改善子鼠皮层、海马神经元凋亡从而改善FGR子鼠神经系统损伤，有助于提高日后学习记忆能力。

3.2 FGR的长远影响

据报道，FGR新生儿智力和精神运动障碍发生率较正常儿明显增加[7]。Geva等[11]对123例FGR和正常儿童进行了为期9年的随访，发现FGR组儿童智商、学习成绩、学习记忆、语言、创造性等能力均比正常组儿童明显降低。FGR患者生长及智力发育缓慢、滞后。成年后是发生内分泌代谢障碍、心血管疾病、阻塞性肺疾病、肾脏疾病和内分泌代谢障碍等疾病的高危人群。因此，及早发现、及早干预FGR对儿童生长发育有深远的意义。如何改善FGR胎儿神经系统损伤，提高日后学习记忆能力，日益为众多学者所关注。卵磷脂修复受损脑细胞，改善脑部血液循环同时维持脑神经细胞功能，加快神经传导。卵磷脂为大豆油生产的副产品，来源广泛，其独特的生理功能为人们所认识，作为食品可为人们所摄取。本研究通过补充卵磷脂改善FGR子鼠缺血性脑损伤，正是基于卵磷脂所含有的磷脂酰胆碱作为神经递质对神经系统发育有重要作用，为探寻通过早期营养干预改善FGR新生儿神经系统发育提供思路。

[1] Mahajan SD,Aalinkeel R,Singh S,et al.Endocrine regulation inasymmetric intrauterine fetal growth retardation[J].J Matern Fetal Neonatal Met,2006,19 (10):615-623.

[2] Alberry M,Soothill P.Management of fetal growth restriction[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal ED,2008,92 (1):F62-67.

[3] Heazell AE,Moll SJ,Jones CJ,et al.Formation of syncytialknots is increased by hyperoxia,hypoxia and reactive oxygenspecies[J].Placenta,2007,29 (SupplA):S33-40.

[4] Chang CH,Tsai PY,Yu CH,et al.Prenatal detec-tion of fetal growth restriction by fetal femur volume:efficacy assessment using three-dimensional ultra-sound[J].Ultrasound Med Biol,2007,33 (3):335-341.

[5] 霍永琛．大豆卵磷脂的研究进展[J]．明日科学与技术，2007，27(3)：113-117．

[6] 池莉平,朱展鹰,黄俊明,等.大豆卵磷脂改善记忆作用动物实验研究[J].中国热带医学,2006,(11)：96-98.

[7] Chang CH,Tsai PY,Yu CH,et al.Prenatal detec-tion of fetal growth restriction by fetal femur volume:efficacy assessment using three-dimensional ultra-sound[J].Ultrasound Med Biol,2007,33 (3):335-341.

[8] Fernmandez-Carrocera LA,Chavez-Torres R,Casanueva E,et al.Intrauterine growth retardation and neurodeveopment at one year of age in Mexican children[J].Nutri Res,2007,23:1-8.

[9] Morrisr GM,Garrudp P,Rawlinsjnp,et al.Place navigation imparied in rats with hippocampal lesions[J].Nature,1982,297(5868):681-683.

[10] Hayakawa M,Mimura S,Sasaki J,et al.Neuropathological changes in the cerebrum of IUGR rat induced by synthetic thromboxane A2[J].Early Hum Dev,2005,55:125-136.

[11] Geva R,Eshel R,leitner Y,et al.Neuropsycholigical out-com of children with intrauterine growth restriction:a 9-year prospective study[J].Pediatrics,2008,118:91-100.