生长抑素受体亚型SSTR2、SSTR5在人原发性肝癌组织中的表达*1

王庆才 宫 健 徐晓丽 胡月华 张 珺 侯 刚 丁惠国

(1.泰山医学院附属泰山医院消化内科，山东 泰安 271000；2.首都医科大学附属北京佑安医院消化二科，北京 100069)

应用免疫组织化学方法检测人原发性肝癌组织中生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR)亚型SSTR2 、SSTR5的表达情况，从形态学上观察该两种受体的表达部位，为生长抑素类似物(somatostatin analogue，SSTA)治疗原发性肝癌提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

25例肝癌组织来源于住院行肝脏肿瘤切除术的原发性肝癌患者，其中男性23例，女性2例；年龄24～71岁，平均年龄51岁。24例为慢性乙肝病毒感染，1例为慢性丙肝病毒感染。同时取其中14例癌旁肝硬化组织。将新鲜组织投入10%中性福尔马林固定液中固定，梯度乙醇溶液脱水，二甲苯溶液透明，石蜡浸蜡和包埋，然后进行切片和贴片。

1.2 免疫组织化学染色

将组织切片应用二甲苯脱蜡、梯度乙醇溶液脱水，将组织切片浸入柠檬酸盐缓冲液用微波进行抗原修复，加入过氧化酶阻断液，再用非免疫动物血清进行孵育，然后每张切片分别加入SSTR2抗体(H-50 sc-25676，SANTA CRUZ公司)、SSTR5抗体(Catalog Number:AB5681，CHEMICON公司)室温下孵育(抗体稀释度1︰200)，再加入生物素标记的第二抗体(UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒 KIT-9710，福州迈新生物技术开发有限公司)室温下孵育，然后加入DAB溶液进行显色并在显微镜下观察，最后用苏木素溶液进行复染、梯度乙醇溶液脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固。同时分别用PBS液和与SSTR抗体来源的同一动物免疫前血清来替代SSTR抗体作为阴性对照实验，用人胰腺组织的石蜡切片进行染色作为阳性对照实验。

1.3 统计学分析

应用χ2检验分析肝癌的分化程度、TNM分期、血清AFP水平、乙肝病毒水平、肝功能Child-pugh分级等与受体表达率的关系，用SPSS for Windows 11.5统计分析软件对数据进行统计处理，以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝癌组织和癌旁肝硬化组织SSTR2、SSTR5免疫组化结果

25例肝癌组织，其中仅SSTR2染色阳性者6例，占24%；仅SSTR5染色阳性者4例，占16%；SSTR2、SSTR5均染色阳性者8例，占32%；SSTR2、SSTR5均染色阴性者7例，占28%，即至少表达一种受体者18例，占72%。SSTR阳性染色主要位于肝癌细胞胞浆及胞膜，呈片状或块状分布，见图1，2；在部分肝癌组织中可见增生的胆管上皮细胞SSTR2、SSTR5染色阳性，见图3，4。

14例癌旁肝硬化组织仅SSTR2染色阳性者3例，占21.4%；仅SSTR5染色阳性者3例，占21.4%；SSTR2、SSTR5均染色阳性者4例，占28.6%；SSTR2、SSTR5均染色阴性者4例，占35.7%。

图1 肝癌细胞SSTR2染色阳性(×400)

图2 肝癌细胞SSTR5染色阳性(×400)

图3 肝癌组织中增生胆管上皮细胞SSTR2染色阳性(×400)

图4 肝癌组织中增生胆管上皮细胞SSTR5染色阳性(×400)

2.2 SSTR2、SSTR5阳性表达与肝癌临床病理因素的关系

将肝癌病例分别分为高分化组和中分化组、TNMⅠ～Ⅱ期组和Ⅲ～Ⅳ期组、AFP阳性组(AFP>400 ng/mL)和阴性组(AFP≤400 ng/mL)、HBV-DNA 阳性组(HBV-DNA≥103copies/ml)和阴性组(HBV-DNA<103copies/ml)、Child-pugh分级A级组和Child-pugh分级B级+C级组，应用χ2检验分析各两组间SSTR2以及SSTR5表达率的差异，经统计分析后P值均大于0.05，未发现以上各组SSTR的表达率存在差异。 见表1。

表1 SSTR表达率与肝癌临床病理因素的比较

3 讨 论

体外多种细胞实验的有关研究发现了生长抑素受体在肿瘤细胞增殖和凋亡中的作用, 如SSTR1、SSTR2、SSTR4、SSTR5与细胞周期G1期停止有关，而SSTR2、SSTR3则与细胞凋亡有关[1]。生长抑素还可以抑制部分肝癌细胞系的生长[2]。现在用于临床治疗的生长抑素类似物(somatostatin analogue，SSTA)，对于SSTR2有高度的亲和力，对于SSTR5的亲和力次之，对SSTR3亲和力较弱，对SSTR1 和SSTR4无亲和力[3]。由于具有抗细胞增殖、促进细胞凋亡的功能，表达于肿瘤的生长抑素受体，特别是SSTR2和SSTR5，已经被作为恶性肿瘤治疗的靶点。虽然SSTA已开始临床用于中晚期肝癌的治疗，但对其有效性目前仍存在争议。推测这些SSTA产生的效应很大程度上取决于其对于靶组织相应受体的直接刺激作用。因此，肿瘤组织中SSTR亚型表达的类型和数量可能决定了SSTA治疗肿瘤所产生的生物效应的差异，不同个体间受体表达类型和数量存在的变异可能是SSTA临床效应存在差别的原因。

刘建生等[4]，颜登国等[5]发现人肝癌组织有SSTR mRNA的表达，我们通过应用免疫组织化学方法在受体蛋白质水平进行分析的结果表明，72%的肝癌组织至少表达SSTR2、SSTR5两种受体其中的一种，受体表达部位位于肝癌细胞的胞膜以及胞浆，这与先前Blakerd等[6]的研究结果相似。所以在不同的肝癌组织SSTR的表达存在差异性。那些同时表达SSTR2和SSTR5两种受体亚型而且表达受体数量多的组织细胞会对生长抑素类似物的作用产生较为明显的受体后效应，所以有可能是这部分受体表达阳性的病人应用SSTA进行治疗才会产生有益的效果，这有助于解释目前应用长效SSTA治疗晚期原发性肝癌的临床实验之间结果不尽一致的原因。因此，如果在临床实验应用SSTA治疗前对肝癌组织SSTR表达情况包括表达形式和表达数量进行分析和筛选, 将足量表达SSTR者或者表达对SSTA抗肿瘤作用发生效应的SSTR者作为治疗组，那么将使这一部分病人受到最大益处，而避免了盲目的用药，节省了治疗费用。目前对生长抑素及受体和肝癌之间关系的研究尚处于起步阶段，通过进一步的实验研究SSTR五种亚型在肝癌细胞增殖和凋亡中的具体作用以及由哪些受体亚型介导这种作用，这将会使我们进一步明确和证实生长抑素及其受体在肝癌治疗中的作用。另外，随着研制出对生长抑素受体亲和力更强、选择性更广泛的生长抑素类似物，将会有更多的肝癌病人从治疗中受益，这将为肝癌的治疗开辟一条新的道路。

我们发现在某些肝癌组织中增生的胆管上皮细胞也有SSTR2和SSTR5的明显表达，这提示我们对于这些增生的胆管上皮细胞，生长抑素类似物可能也有抑制作用。而且，对于少见的原发性胆管细胞癌，其是否也表达生长抑素受体，这需要收集足够的原发性胆管细胞癌病例进行研究来证实。

在所研究的肝癌样本中，肿瘤的分化程度、TNM分期、血清AFP水平、乙肝病毒DNA水平和肝功能Child-pugh分级等都与SSTR2和SSTR5的表达率无关，这提示这些参数对于与生长抑素类似物治疗存在相关的SSTR的表达情况可能都不是可预测的。

[1] Benali N, Ferjoux G, Puente E,et al.Somatostatin receptors[J]. Digestion, 2000,62 (Suppl 1):27-32.

[2] Raderer M, Hejna MH, Muller C, et al. Treatment of hepatocellular cancer with the long acting somatostatin analog lanreotide in vitro and in vivo[J].Int J Oncol, 2000,16:1197-1201.

[3] Patel YC. Somatostatin and its receptor family[J]. Front Neuroendocrinol, 1999, 20: 157-198.

[4] 刘建生,彭淑牖,吴育莲,等.人类生长抑素受体mRNA在原发性肝癌中的表达[J]. 中华消化杂志,2002,22(11):683.

[5] 颜登国,区庆嘉,李江涛,等.原发性肝癌生长抑素受体mRNA表达的研究[J].中华普通外科杂志,2003,18(1):55-56.

[6] Blaker M, Schmitz M, Gocht A, et al. Differential expression of somatostatin receptor subtypes in hepatocellular carcinomas[J]. J Hepatology,2004,41:112-118.