活性氧诱导离体大鼠耳蜗Corti器毛细胞凋亡的观察

原红艳 张淑香 李兴启 李树华

细胞凋亡是内耳感觉上皮毛细胞的一种重要损伤方式。以往有学者通过在体的噪声性聋、顺铂及氨基糖苷类抗生素等药物性聋等实验模型间接推测氧自由基可诱导毛细胞凋亡[1,2]，但利用氧自由基的直接损伤模型观察细胞凋亡鲜有报道。本实验利用耳蜗体外培养技术，建立一种离体耳蜗的活性氧(reactive oxygen species,ROS)损伤模型，观察外源性过氧化氢(H2O2)直接诱导离体培养大鼠耳蜗Corti器毛细胞凋亡的规律。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用新生1～5 d龄SD大鼠24只(购自中国人民解放军总医院实验动物中心)，雌雄不拘，随机分为4组，每组6只12耳：①无血清培养液组(H2O2浓度为零)；②0.05 mmol/L H2O2组；③0.1 mmol/L H2O2组；④0.5 mmol/L H2O2组。

1.2实验步骤

1.2.1建立新生大鼠耳蜗Corti器体外培养模型系统。将大鼠在-20℃环境下低温麻醉3～5分钟，待皮肤变白、不能活动后，浸于75%乙醇中消毒2分钟后取出；眼科剪断头，剪开颅骨，去除脑组织，剪下颞骨，置于盛有PBS的培养皿中，在超净工作台的解剖显微镜下分离出Corti器，并用尖刀按顶回、中回、底回将其分为3段；将分割好的组织片段移入盛有1 ml无血清培养液(serum-free medium)的培养皿中，并使其下沉到培养皿底部，最后将培养皿缓慢移入37℃、5%CO2培养箱进行培养。整个解剖过程必须迅速、准确，严格无菌操作。

本实验所采用的无血清培养基配方如下：1хDMEM 96.4 ml(Hyclone SH30022-01)、serum-free supplement 1 ml(Sigma I-1884)、20%葡萄糖2.4 ml(Sigma G-2020)、青霉素G 0.2 ml(Sigma P-3414)、谷氨酰胺(glutamine)1 ml(Sigma G-6392)。实验前需将此培养液放入37℃恒温箱中预热10分钟。

每日在倒置显微镜下观察Corti器生长情况，记录培养液的颜色，培养物的形态、颜色、光泽、生长密度及范围，并摄片。每日观察后换新的培养液一次，换液后放回培养箱继续培养。

1.2.20.05、0.1、0.5 mmol/L H2O2组：解剖步骤及培养步骤均同前，次日换液时，吸出原培养液，各培养皿中分别加入含0.05、0.1、0.5 mmol/L H2O2的无血清培养液。

1.2.3AO/PI双重染色 培养48小时后，各组均终止培养。倒置显微镜下观察摄片后，利用AO/PI双重染色法进行凋亡细胞检测，步骤如下：吸干培养皿内培养液，加入含100 mmol/L丫啶橙(acridine orange,AO)及10 mmol/L碘化丙啶(prodium iodine,PI) 的PBS(0.1 mol ，pH6.8)染色15分钟，染色后用PBS充分浸洗，再以4%多聚甲醛固定15～30分钟，最后用PBS冲洗，甘油封固。立即在荧光显微镜下观察并摄影(荧光激发光波长360±10 nm,发射光波长≥500 nm)。在单位长度的显微镜摄影取景框范围内对耳蜗内外毛细胞分别进行计数观察。

1.3统计学方法 所有实验数据经计算机统计软件State 4.0处理，组间差异采用方差分析。

2 结果

2.1显微镜下观察H2O2诱导的耳蜗毛细胞凋亡的细胞形态学改变 培养48小时后,无血清培养液组耳蜗基底膜的毛细胞保持良好的形态结构,在倒置显微镜下可见3排外毛细胞、1排内毛细胞及支持细胞，内、外毛细胞排列整齐，无变性坏死(图 1)。低浓度H2O2组(0.05、0.1 mmol/L)毛细胞基本保持原有排列状态，部分细胞形态学发生改变，出现水肿及碎裂(图2)。0.5 mmol/LH2O2组毛细胞失去原有排列规律，结构紊乱，出现部分缺失，细胞形态学亦发生改变(图3)。

经AO/PI双重染色后的基底膜，凋亡细胞被染为橙红色，而活性细胞则为亮绿色(图4～6)。分别计数单位长度基底膜上凋亡毛细胞数及毛细胞总数，计算相应的内外毛细胞凋亡率。各组耳蜗毛细胞凋亡率见表1。各组中支持细胞均保持良好活性，未见凋亡及缺失(图1～3)。

2.2耳蜗不同部位毛细胞的凋亡规律 耳蜗不同部位毛细胞凋亡率各不相同，除了0.05 mol/L H2O2组各回内毛细胞无调亡外，其余各浓度H2O2组由顶回向底回IHC、OHC的凋亡均逐渐加重，各回中OHC的凋亡均明显重于IHC，且随着H2O2浓度增加，各回内外毛细胞凋亡逐渐加重(表1)。

3 讨论

研究表明在氨基糖苷类抗生素、卡铂及噪声引起的耳聋中，均有Corti器毛细胞的凋亡，而且活性氧自由基在其中起重要作用[3～5]。本研究显示，不同种类细胞对H2O2毒性敏感性不同，OHC最敏感，IHC次之，支持细胞未受到任何影响。与IHC相比，OHC的独特结构是其易受ROS攻击的基础[6]。耳蜗OHC壁由质膜构成，通过膜下池系统与中间的皮板层或细胞骨架弹性蛋白结合，其侧面衬以线粒体和内质网，线粒体和内质网的囊泡结构是ROS的产生和受损害的靶[7]。此外,ROS改变了膜的通透性造成细胞内游离Ca2+增多是ROS造成OHC损伤的另一个原因。有报道证明ROS作用于游离的OHC能够使其细胞膜上的Ca2+流增多且形态学发生改变，细胞膜损伤后胞溶性Ca2+在胞内积聚也增加，胞内Ca2+积聚导致的细胞毒性作用包括胞内构架的破坏、DNA断裂形成碎片、细胞器如线粒体的损伤[8]。有学者认为ROS的损害机制是它破坏了肌动蛋白微丝、角蛋白中间纤维和微管，还可能是从其抛锚的浆膜上断离了细胞骨架蛋白[6]。Clerici等在离体OHC实验中发现ROS可引起耳蜗OHC突触前膜囊泡数量增加和耳蜗OHC的平均长度缩小，这证明了核膜磷脂的过氧化作用[8]。而支持细胞上存在着NO/cGMP途径,该途径可对细胞内的Ca2+升高起到负反馈调节作用,从而降低支持细胞内的Ca2+浓度,阻断钙超载引起的细胞死亡[9]，这可能是支持细胞不易受ROS攻击的原因之一。此外，耳蜗各种细胞中还原型谷胱甘肽(glutathlione,GSH)的含量不同也导致它们对H2O2敏感性不同，其中OHC中GSH含量很低，故其清除ROS能力弱，损伤最重；而IHC和支持细胞中GSH含量较高[10]，不易受H2O2毒性损伤。

图1倒置显微镜下观察无血清培养液组基底膜(底回) OHC、IHC及支持细胞均排列整齐，轮廓清晰，活性良好，图中箭头所示分别为OHC及IP(内柱细胞)(×200)
图2 0.05 mmol/L H2O2组毛细胞(底回) 基本保持原有排列状态，但折光性较差 活性欠佳，图中箭头所示分别为OHC及IP(内柱细胞)(×200)
图3 0.5 mmol/L H2O2组基底膜(底回) OHC几乎全部凋亡，只有少量OHC仍保持活性(箭头所示)，IHC也部分凋亡，而Deiters细胞(D)始终保持完好(箭头所示)(×200)
图4无血清培养液组毛细胞(底回) 排列整齐，形态正常(箭头所示)(AO/PI双重染色)(×100)
图5 0.05 mmol/L H2O2组(底回) 可见少量毛细胞凋亡，被PI染为橙红色(箭头所示)(AO和PI双重染色)(×200)
图6 0.5 mmol/LH2O2组(底回) 可见大量凋亡毛细胞(箭头所示)(AO和PI双重染色)(×200)

表1 不同浓度H2O2诱导的耳蜗不同部位内、外毛细胞的凋亡率

注：*分别与同组中回及顶回内毛细胞凋亡率比较，P<0.05;△分别与其他两组底回内、外毛细胞凋亡率比较，P<0.05

本实验结果显示耳蜗不同部位对H2O2的敏感性也不同，底回损伤最重，顶回和中回无明显差异。Ska等[2]在单离外毛细胞的培养过程中已发现随着时间延长，顶回OHC存活率高于底回，且死亡细胞的形态特征与凋亡相同，同时，还检测到顶回OHC的GSH水平明显高于底回。因此提示各回OHC对凋亡的不同易感性是由于它们清除活性氧的能力不同造成的。

4 参考文献

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