亳芍茎尖组织培养的研究

马宗新,马同富,孟冬青

(1.阜阳市农业科学研究所,安徽阜阳 236065;2.阜阳师范学院,安徽阜阳 236041)

亳芍 (Paeonia lactifloraPall.)即白芍,因产于亳州而得名,为毛茛科多年生草本植物,中国芍药栽培已有 3 900年的历史[1]。白芍,来源于芍药及其变种的根。9～10月采挖 3～5年生的根,除去地上茎及泥土,经过水洗,放入开水中煮 5～15 min至无硬心,取出用竹刀刮去外皮,晒干,露出白茎,故名曰“白芍”。亳州芍药,《药典》称亳芍。性微寒,味微苦而酸,有镇痛、镇静、解痉的作用,主治月经不调、经前腹痛、盗汗、头痛等。亳芍的产量约占全国的70%以上,其花形美丽,花色富丽自古以来就受人们喜爱,与牡丹并称为“花王”和“花相”,素有“花中皇后”的美称。每年的“五一”前后,是芍花盛开的季节,盛开的芍药花香四溢,景色宜人,具有很好的观赏价值。其花不仅是一种观赏植物,也是一种良好的保健品,化妆品。因亳州白芍质地优良,药用价值高,亳州遂成了全国闻名的白芍集散地。

近年来人们对芍药的药用价值研究发现:白芍总苷 (TGP)对犬实验性缺血心肌具有保护作用,除此之外,芍药碱、芍药酮、芍药苷等都具有很好的药用价值。虽然人们对芍药药用成分的研究取得了可喜的成绩,但对芍药组织培养的研究很少。本试验选取了亳芍的茎尖为试验材料,探究不同植物生长调节剂及浓度对组织培养的影响,以期找到亳芍茎尖组织培养的最佳方案。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料来源

2007年 12月,亳芍采自安徽省亳州市中药材研究所基地。

1.1.2 试验时间和地点

试验于 2008年 3月初～5月中旬在阜阳市农业科学研究所组培室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配比

以 1/2MS培养基为基本培养基,附加 3%蔗糖,琼脂 0.4%,pH值调至 5.8。以植物生长调节剂 6-BA,NAA,I BA不同组合及其浓度组合,分别配成启动培养基,增殖培养基,生根培养基。(详见表1)

表1 各培养基植物生长调节剂及浓度

1.2.2 无菌材料的获得

在盆栽中取长势良好的亳芍顶芽和侧芽剥去表面的叶片,用洗衣粉洗去表面尘土,自来水冲洗10 min。接着进行表面灭菌,用 75%的乙醇溶液浸泡 30 s,接着在升汞溶液浸泡 8 min进行灭菌。将经表面灭菌处理的实验材料,用无菌水冲洗 4次,剥取直径为 1.0～2 mm的茎尖,迅速接种于启动培养基上。

1.2.3 丛生芽的诱导

以上述无菌材料为外殖体进行丛生芽初步诱导及启动培养基的筛选。选取 1.0～2 mm的茎尖接种在表1所示的各种处理的启动培养基上,每个处理为 6瓶,每瓶接种 1个茎尖,观察并记录每个处理芽的数量并求出平均值。比较不同浓度的 6-BA、NAA,对丛生芽的形成和芽增殖率的影响程度;从中选出最有利于茎尖成活,芽增殖最多的一种。

1.2.4 继代培养

将诱导产生的丛生芽接种在表1所示各种处理的继代培养基上,每种配制 300 mL分装 6瓶,每瓶接种 1个茎芽,选取的茎芽大小长势接近。每隔 10 d观察并记录每瓶芽的生长情况,求出平均值。

1.2.5 生根培养基培养

把上述长势良好的丛生芽分化出的芽苗,接种在表1所示各种处理的生根培养基上,每种配制250 mL分装 5瓶,每瓶接 3种株,分别在接种 15 d,30 d观察并记录生根情况。

1.2.6 培养条件

以日光灯为光源,光照强度 1 500～2 000 lx,每天光照 10～12 h,温度在 25℃左右。

2 结果与分析

2.1 消毒剂及灭菌方法比较

获得无菌材料是进行组织培养的前提,通过 3种不同消毒方法和消毒剂的比较试验,以便选择伤害力小且污染率低的消毒剂和灭菌方法。不同消毒剂种类及消毒方法的效果试验结果见表2。

表2 不同消毒方法和消毒试剂对外植体的影响

表2结果表明,方法 2用 2%NaClO消毒 3 min后再用 0.1 HgCl2消毒 6 min灭菌效果较好,没有污染,但对外植体的杀伤力也很强,获得的无菌材料存活率也较低;方法 3对外植体的杀伤力虽然很低,存活率高,但灭菌效果也低,污染严重。只有方法 1直接用 0.1 HgCl2灭菌效果好,对外植体的杀伤力也低,存活率高。因此选择消毒剂的时候,既要考虑能杀死附在外植体上的微生物,又要尽量不伤害组织细胞。试验结果表明,外植体的最佳消毒方案是:用洗衣粉洗去表面尘土,自来水冲洗 10 min,接着进行表面灭菌。用 75%的乙醇溶液浸泡 30 s,在升汞溶液浸泡 8 min进行灭菌。然后将经表面灭菌处理的试验材料,用无菌水冲洗 4次。

2.2 启动培养基筛选

在植物细胞生长过程中不仅需要营养元素,也需要生长调节剂。生长调节剂是植物良好生长的前提,需要量比较少,需要有一个最适浓度,浓度过高或过低都会影响植物生长。为此进行了不同浓度的植物生长调节剂的比较试验,选择最佳的培养基配方。培养结果见表3。由表3可以看出,在只有 6-BA 1.0时芽的数量最多;在 6-BA 1.0有 NAA时也能长芽,但 NAA的浓度越高,芽的数量越少;在 6-BA浓度高于 1.0或低于 1.0时,芽的数量也不多。可见启动培养基的最佳配方是:1/2MS+6-BA 1.0 mg/L。

表3 启动培养基中植物生长调节剂的组合与浓度

2.3 继代培养基的筛选

不仅在诱导芽的过程中需要有植物生长调节剂,在继代培养过程中也需要有一个最适值。通过不同浓度生长调节剂的比较试验,找到最佳的配方。培养结果见表4。由表4可以看出,在没有任何植物生长调节剂情况下,即在 1/2MS条件下虽能生长,但长势不好;在加有 6-BA 1.0和 NAA 0.5的1/2MS上长势比只有 1/2MS长势好;在加有 6-BA 1.0条件下长势最好。因此最佳继代培养基是:1/2MS+6-BA 1.0 mg/L。

表4 继代培养基中生长调节剂组合与浓度

2.4 生根培养基筛选

将高 1.5 cm具 2个节的健壮苗接种于添加不同植物生长调节剂组合的 1/2MS培养基上。10 d后,培养苗的生根情况见表5。

由表5可以看出,在没有添加任何植物生长调节剂的 1/2MS培养基上,亳芍试管苗也能生根,但生根数少,启动天数长,根比较细并且很弱;添加不同的浓度的 I BA和NAA。均能改善生根情况,其中0.1 mg/L I BA与 0.5 mg/L NAA均能增强根的数量和粗壮程度,但在添加了 I BA的培养基上苗出根数最多,因此,确定最佳的生根培养基为 1/2MS+I BA 0.1 mg/L。

表5 生根培养基中生长调节剂组合与浓度

3 讨论与结论

通过试验研究,我们探讨出各阶段较为理想的培养基配方,培养出了大量的试管苗。

3.1 消毒剂与消毒时间的选择

不同的消毒剂及消毒时间,对外植体的消毒效果和毒害作用不同。有的消毒剂对外植体的消毒效果很好,污染率低。但是对外植体的杀伤率却很高,造成大量的外植体死亡。需要培养很多的材料。不利于培养。有的消毒剂对外植体的伤害很小,但灭菌效果很差,污染严重。同样不利于培养。因此选择一种或几种消毒剂配合使用,以期达到灭菌效果又好,对材料的伤害又低就很有必要了。通过研究发现,在亳芍茎尖组织培养中,用 0.1 mg/L升汞消毒 8 min效果最好,既达到好的灭菌效果又对材料伤害小。

3.2 植物生长调节剂对亳芍的影响

在亳芍茎尖组织培养的启动过程中发现,芽形成多少与长势好坏与 6-BA和 NAA有密切关系:在只有 6-BA没有NAA情况下其长势更好。这很好的说明了细胞分裂素有促进细胞分裂和扩大的生理作用[2]。BOU ZAL等认为 6-BA是维持和繁殖外殖体的必需元素。并且是唯一对芍药叶和腋芽有效的细胞分裂素[3],同时发现亳芍茎尖过小不易成活。初步掌握了茎尖的大小尺寸在 1～2 mm最佳;在丛生芽继代培养过程中,本着在培养基各成分中植物激素的作用最大的原则[4],设计 6-BA与其它的细胞分裂素和生长激素构成不同的培养基类型,研究发现在只有6-BA 1.0 mg/L时增殖系数最大。试验还发现,具有细胞分裂活性的 6-BA可以有效的诱导生长点的分化[5];在分化苗的生根的研究中,发现 I BA较 NAA的生根效果好,且 I BA 1.mg/L的效果最好。研究发现,在茎分化成苗的过程中,来源于增殖系数大的茎,在相同的培养基上前期生根率较低,而后生根率迅速提高。我们认为这可能与细胞的成熟度及内外源激素的作用有关,关于这一点有待于进行细胞解剖学研究和内外源激素的定量分析。

3.3 植物生长调节剂浓度对亳芍的影响

在亳芍茎尖组织培养的过程中发现,芽形成多少与长势好坏,丛生芽的增殖数的多少,以及生根效果好坏都与植物生长调节剂的浓度有关系:有一个最适浓度,浓度过高或过低都不利于组织培养。

在基本培养基中,附加生长素和细胞分裂素的比单一附加生长素的愈伤组织的诱导率高,生长质量好,这与欧李茎的实验结果一致[6]。芍药属植物组织培养途径多直接通过芽增殖的方式进行扩繁[7-9],很少通过愈伤组织途径,目前仅有牡丹愈伤组织的诱导和分化的报道[10]。何丽一,于津等揭示出芍药苷 (paeonifbrin)是芍药属植物中的特性成分[11-13],因此其愈伤组织的诱导和分化是否与芍药苷的存在有关联还有待进一步研究。

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