大孔树脂吸附法分离海金沙总黄酮的研究

欧阳玉祝,车少林,黄伟涛

(1.植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室,湖南吉首 416000;2.吉首大学化学化工学院,湖南吉首 416000)

海金沙 (Lygodium japonicum)是一种富含多酚和黄酮类化合物的多年野生草质藤本植物,具有抗菌消炎、降低血管脆性、抗氧化和抗衰老、清除羟基自由基等功效[1],不仅是一种良好的抗菌药物,而且是一种优良的天然食品抗氧剂。研究表明:合成抗氧剂 BHA、BHT有致癌作用[2],天然抗氧剂对油脂和含脂食品具有比合成抗氧化剂更强的抗氧化活性和自由基清除能力,这就使天然抗氧剂成为当今人们关注和研究的热点[3-4]。大孔吸附树脂分离技术是近年来发展起来的分离精制技术,具有化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、分离费用低等优点,广泛用于化工、医药、食品和环保等领域[5-8]。本实验用海金沙为原料,用大孔树脂吸附法分离总黄酮,研究其分离工艺条件。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和药品

1.1.1 实验仪器

UV-2450型紫外可见光分光光度计 (日本岛津公司);KQ-250E型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);SHB-III循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司);DF-101S集热式恒温磁力搅拌器 (郑州长城科工贸有限公司);FA2104N分析天平 (上海精密科学仪器有限公司)。

1.1.2 实验药品

海金沙采自湖南永州,采回的样本经洗净、晾干、切碎,于 60℃,0.08 MPa真空干燥后,用植物粉碎机粉碎到 60目,置于干燥器中备用;大孔吸附树脂是天津光复精细化工研究所生产;乙醇,氢氧化钠,盐酸,醋酸,亚硝酸钠,硝酸铝为国产分析纯试剂;芦丁对照品为中国药品生物制品鉴定所生产。

1.2 实验方法

1.2.1 大孔树脂的预处理

D-101大孔吸附树脂按参考文献[8]进行预处理。

1.2.2 海金沙总黄酮的提取

取 50 g海金沙按参考文献[9]用超声波辅助提取法提取总黄酮,提取液定容到 500 mL备用。

1.2.3 总黄酮的分离

取 5.0 g D-101大孔树脂于 250 mL锥形瓶中,按一定的固液比加入实验量的提取液,在一定温度下吸附,抽滤,树脂再用一定浓度的乙醇溶液做解吸剂洗脱黄酮,收集洗脱液于 50 mL容量瓶中定容至刻度,分析总黄酮含量,并计算提取率。

1.3 分析方法

1.3.1 总黄酮标准曲线的绘制

用干燥芦丁作标样,按参考文献 [9]测 510 nm处吸光度,以吸光度为横坐标,浓度为纵坐标绘图,实验结果用计算机进行线性回归得回归方程和相关系数如下:

式中:C为总黄酮浓度(mg/mL),A为吸光度。

1.3.2 样品总黄酮的分析

取分离产物的溶液,用紫外可见光分光光度计测 510 nm处吸光度,结合回归方程计算总黄酮质量,按下式计算总黄酮提取率。

2 结果与讨论

2.1 吸附树脂的选择

准确称取 5.0 g(湿重)经预处理的大孔树脂,置于 100 mL圆底烧瓶中,加 50 mL海金沙提取液,在振荡器上振荡吸附 180 min,达到吸附平衡后,测定溶液的吸光度,按下式计算吸附率,结果如图1所示。

式中:C1为开始吸附时海金沙溶液总黄酮浓度,C2为吸附平衡时海金沙溶液总黄酮浓度 (mg/mL)。

图1 吸附剂种类对总黄酮吸附率的影响

图1结果表明:D-101大孔吸附树脂对海金沙总黄酮的吸附率最大,其数值为 88.7%。因此,选择 D-101大孔吸附树脂为吸附剂。

2.2 海金沙总黄酮分离条件实验

2.2.1 分离条件正交试验

2.2.1.1 正交试验因素水平设计

采用L9(34)正交试验法,因素水平随机编号,以海金沙总黄酮提取率为指标,研究固液比 (A),吸附温度 (B),吸附时间 (C)和解吸剂浓度 (D)4因素对海金沙总黄酮提取率的影响,正交试验水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

2.2.1.2 正交试验结果与极差分析

根据正交试验水平表对乙醇浓度、固液比、吸附温度和时间作四因素三水平正交试验,实验结果和极差分析如表2所示。

表2 L9(34)正交试验结果及极差分析

表中 Ki值 (i=1、2、3)表示第 j列 (j=1、2、3、4)中第 i水平所对应的数据之和,Ki值是对应的 Ki值的平均值,极差是 Ki的最大值与最小值之差。表2可知,各因素影响程度由大到小依次为:D>A>C>B。总黄酮提取的优水平为:D2A1C1B2,即固液比 1∶8(g/mL),乙醇浓度为 70%,超声提取温度 50℃,提取时间 90 min。

2.2.2 分离条件单因素影响实验

2.2.2.1 解吸剂浓度对总黄酮提取率的影响

为了考查解吸剂对总黄酮提取率的影响,在吸附固液比 1∶8(g/mL),50℃温度下吸附 90 min,考查不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响,结果如图2所示:

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

图2结果表明:用 70%乙醇作解吸剂,总黄酮提取率最大为 1.8%。因为大孔树脂分离过程包括吸附和洗脱两步,在相同吸附条件的洗脱过程中,70%乙醇水溶液作解吸剂有利于破坏树脂对黄酮吸附的分子间作用力和氢键,使黄酮容易从吸附树脂上洗脱扩散到溶液中。

2.2.2.2 吸附时间对总黄酮提取率的影响

为了考查吸附时间对总黄酮提取率的影响,在吸附固液比为 1∶8(g/mL),50℃温度下吸附一定时间,抽滤,树脂用 70%乙醇为解吸剂洗脱黄酮化合物,结果如图3所示:

图3 吸附时间对总黄酮提取率的影响

图3结果表明:随着吸附时间的不断增加,总黄酮的提取率增大,吸附 90 min后,总黄酮提取率增加很小,说明吸附 90 min达到吸附平衡,平衡后,各组分含量基本不变,取吸附时间为 90 min。

2.2.2.3 固液比对总黄酮提取率的影响

吸附固液比不同,吸附剂用量不同,吸附质的吸附量不同,总黄酮提取率将不同。为了考查吸附固液比对海金沙总黄酮提取率的影响,在 50℃温度下吸附 90 min,抽滤,树脂再用 70%乙醇解吸,结果如图4所示:

图4 吸附固液比对总黄酮提取率的影响

图4结果表明:吸附固液比以 1∶6(g/mL)时最大,总黄酮提取率为 1.84%。因为固液比增加,提取液用量增大,吸附剂用量相对减少,导致提取液中总黄酮吸附不完全,使总黄酮提取率减小。

2.2.2.4 吸附温度对总黄酮提取率的影响

就吸附过程而言,吸附温度的高低会直接影响吸附与解吸平衡。在吸附固液比为 1∶8(g/mL)条件下吸附 90 min,再用 70%乙醇进行解吸,考查吸附温度对海金沙总黄酮提取率的影响,结果如图5所示:

图5 吸附温度对总黄酮提取率影响

图5结果表明:吸附温度在 50℃时海金沙总黄酮的提取率最高为 1.83%。50℃以下,随温度升高提取率增加,大于 50℃后,随温度升高总黄酮提取率减小。因为D101大孔树脂对黄酮的吸附属物理化学吸附,低温以化学吸附为主,化学吸附是吸热反应,温度升高有利于吸附;到 50℃后转为物理吸附为主,物理吸附是放热反应,温度升高不利于吸附,所以黄酮提取率减小;此外,温度升高,黄酮化合物氧化速度加快。

2.3 最佳分离条件组合实验

综合正交试验和单因素影响实验结果确定最佳分离条件为:用 70%乙醇为解吸剂,吸附固液比为 1∶6(g/mL),吸附温度为 50℃,吸附时间为 90 min。为了考查最佳分离条件下组合实验效果,在此条件下做组合实验,结果如表3所示。

表3 最佳分离工艺条件组合实验结果

实验结果表明,在最佳分离工艺条件下提取,总黄酮的提取率为 1.81%,5次实验的精密度较高,相对标准偏差 (RSD)为 1.602%。

3 结 论

用大孔树脂分离海金沙总黄酮,分离效果好、吸附速度快、解吸条件温和,不影响提取物的活性,具有较高的应用价值。实验结果表明:以 70%乙醇为解吸剂,在吸附固液比为 1∶6(g/mL),50℃温度下吸附 90 min,总黄酮提取率为 1.81%。

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