老龙皮总氨基酸的提取工艺研究

王晓梅,赵卫星,常军林,刘 莎,房 咪

(1.宝鸡文理学院化学化工系,陕西宝鸡 721013;2.陕西省植物化学重点实验室,陕西宝鸡 721013;3.宝鸡市中医医院,陕西 宝鸡 721004)

老龙皮[1],别名:石龙皮、石龙衣、癞肚皮、蛇皮苔、石花。为地衣类牛皮叶科肺衣属植物光肺衣Lobaria kurokavaeYosh im,以叶状体入药。生于山区的树干基部、树皮表面、岩石表面或土表。主要用于消化不良,小儿疳积,肾炎水肿,腹水,皮肤瘙痒;外用治烧烫伤,疮疡肿毒 (《全国中草药汇编》)。老龙皮作为地方性药材,广泛地被秦岭当地的人民所应用,但是,有关老龙皮的研究却少有报道。氨基酸是生物体内的生物大分子之一,是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。根据报道[2,3]及我们前期所作的实验,发现老龙皮中含有氨基酸、地衣酸、皂苷类和多糖类物质。本实验首次就老龙皮氨基酸的提取进行了研究与探讨,以期为老龙皮药材的开发提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

老龙皮购自秦岭太白山区,经陕西中医学院胡本祥教授鉴定为牛皮叶科植物光肺衣 Lobaria kurokavaeYosh im的干燥地衣体。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器

BS-244-SS电子天平 (赛多利斯科学仪器有限公司);DK-98-1型电热恒温水浴锅 (天津市泰斯特仪器有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);R-1002旋转蒸发仪(郑州长城工科股份有限公司);ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司);SP-752紫外 -可见分光光度计 (上海圣科仪器设备公司)。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择[4]

(1)配制 0.1 mg/mL的标准 L-酪氨酸溶液。

(2)样品的制备。称取研细的老龙皮 5 g,用70%乙醇,按料液比 (W/V)1∶11,于 75℃回流 2 h,提取 2次,合并 2次滤液,将溶剂蒸干后用双蒸水定容于 50 mL容量瓶中备用。

分别取标准液和样品液各 1 mL加入 2%茚三酮溶液 1 mL和磷酸盐缓冲液 2 mL,摇匀后于水浴加热 15 min,取出,冷却,用蒸馏水定容至 50 mL。再取 1 mL样品溶液稀释至 8 mL,在紫外 -可见分光光度计中进行波长扫描,每种液体平行做 3次,取平均值。结果显示对照品溶液和样品溶液在 570 nm处均有最大吸收。所以,选择 570 nm为本试验的最佳测定波长。由朗伯 -比尔定律计算氨基酸含量,并计算提取率。

2.2 单因素选择实验

2.2.1 提取溶剂浓度的选择

称取研细的老龙皮 5 g,分别用 50%、60%、70%、80%、95%的乙醇 ,按料液比 (W/V)1∶11,于70℃回流提取 2次,每次 2 h,合并 2次滤液,将溶剂蒸干。按 2.1节方法显色定容后,于 570 nm测吸光度A,并计算总氨基酸的提取率。数据分析得图1:

图1 乙醇质量分数的影响

由结果可见乙醇浓度 60%时,样品提取测得的吸光值最大,总氨基酸提取率最高,而浓度小于和大于 60%时则提取率低,可能是因为浓度偏低时样品中非极性氨基酸溶出量少,反之,浓度过高则降低极性氨基酸的溶出,因此以 60%的乙醇为最佳提取浓度。

2.2.2 料液比的选择

称取研细的老龙皮 5 g,用 70%的乙醇,于70 ℃,分别按料液比 (W/V)为 1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20、1∶22.5回流提取 2次 ,每次 2 h,合并两次滤液,将溶剂蒸干,按 2.1节方法显色定容后,于 570 nm测吸光度 A,并计算总氨基酸的提取率如图2。结果显示,当料液比为 1∶20时,样品提取物测得的吸光值最大,总氨基酸提取率最高,因此以1:20为最佳料液比。

图2 料液比的影响

2.2.3 提取时间的选择

称取研细的老龙皮 5 g,用 70%的乙醇,于70 ℃,按料液比 (W/V)1∶11,分别回流 2 h、3 h、4 h、5 h,每个时间提取 2次,合并两次滤液,将溶剂蒸干,按 2.1节方法显色定容后,于 570 nm测吸光度A,并计算总氨基酸的提取率如图3。

图3 提取时间的影响

结果发现提取时间 3 h,样品提取测得的吸光值最大,总氨基酸含量最多,2 h时提取量稍偏低,而在 3 h后随着提取时间的增长,氨基酸提取量减少,可能是因为在较高的温度下,时间越长,乙醇挥发量越多,同时氨基酸被氧化分解的量越多。因此以 3 h为最佳提取时间。

2.2.4 提取温度的选择

称取研细的老龙皮 5 g,用 70%的乙醇,按料液比 (W/V)1∶11,分别于 50℃、60℃、70℃、80℃、95℃下回流提取 2次,每次 2 h,合并 2次滤液,将溶剂蒸干,按 2.1节方法显色定容后,于 570 nm测吸光度 A,并计算总氨基酸的提取率如图4。

图4 提取温度的影响

结果发现从 50℃开始,随温度升高而提取率增高,当提取温度达 70℃时,样品提取测得的吸光值最大,总氨基酸含量最多,而温度升至 80℃及 95℃时,提取量明显降低,原因可能是在 70℃以下时,随着温度的升高,氨基酸由药材中溶出的量越多,而在较高温度下乙醇挥发速度加快,使溶剂的乙醇浓度迅速降低而影响了氨基酸的溶出,因此以 70℃为最佳提取温度。

2.3 最佳提取条件的确定

在单因素试验的基础上,对老龙皮提取总氨基酸的工艺条件进行优化,选用 L9(34)正交试验表安排试验,选择乙醇浓度 (A)、料液比 (B)、提取时间(C)、提取温度 (D)4个因素,每个因素选择 3个水平,确立因素水平表1。结果见表2。

表1 氨基酸提取正交因素及水平设计

表2 氨基酸提取的正交试验结果及分析

正交实验结果 (表2)表明,老龙皮总氨基酸提取最佳条件组合为A2B3C2D2,即提取最佳条件采用60%乙醇作提取溶剂,料液比 (W/V)为 1∶20,在70℃提取 3 h,总氨基酸得率最高。料液比对总氨基酸提取率影响最大,4种因素对提取结果影响大小依次为:料液比 (B)>乙醇浓度 (A)>提取时间(C)>提取温度 (D)。优化实验条件后重复实验,提取总氨基酸的量可达 4.07%。

3 结 论

本研究通过单因素实验分别考察了提取溶剂浓度、料液比、提取温度和提取时间对提取率的影响,通过设计正交实验,优选出最佳提取工艺条件:乙醇浓度 60%,料液比 (W/V)1∶20,提取温度 70℃,提取时间 3 h。本次实验优选出来的实验条件,对今后开发利用老龙皮总氨基酸具有重要意义。

[1] 崔桂友,段 海.中国食用地衣种类的研究[J].江苏农业研究,2000,21(3):59-62.

[2] 靳菊情,丁东宁,边晓丽,等.老龙皮多糖的研究 [J].中药材,1997(7):355-357.

[3] 吴玫涵,马剑文.老龙皮的气相色谱 -质谱分析[J].中国药学杂志,1996(10):29-30.

[4] 梁英丽,李 艳,高孟婷,等.西归中总氨基酸含量测定方法研究[J].大理学院学报,2009,8(10):7-9.