葛花不同工艺提取物的异黄酮成分含量比较研究

姚美村,廖祎婷,袁月梅,汤 毅

(中山大学药学院,广东广州 510006)

葛花是豆科 (Leguminasae)植物野葛 [Pueraria lobata(W illd.)Ohwi]或干葛藤 (Pueraria thom sonii Benth.)的干燥花,《神经农本草经》记载葛花主要用于解酒醒脾,治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕逆吐酸、吐血和肠风下血等,是中医中很具代表性的解酒药物[1]。近年来研究表明葛花中的异黄酮类是解酒、保肝作用的主要有效成分[2-4],包括葛花苷(kakkalide)、尼泊尔鸢尾异黄酮 (irisolidone)、鸢尾苷 (tectoridin)、鸢尾异黄酮 (tectorigenin)、6"-O-木糖鸢尾苷 (6"-O-xylosyl-tectoridin)、金雀花异黄苷 (genistin)和染料木素 (genistein)异黄酮类等。

众所周知,中药若采用不同溶剂进行提取,其化学成分将发生较大变化,对应的有效成分也可能不同;而中药的粗提物中往往含有较多杂质,需要采用各种纯化手段富集其中的药效物质。为了更好的开发葛花这一传统解酒要药,对葛花中异黄酮类成分的进行提取、定性和定量研究确有必要。目前对于葛花提取物中总黄酮的含量测定,已有的文献中多以葛根素或葛花苷为对照品,采用紫外分光光度法(UV)进行测定。而有文献报道[5]这两种成分在葛花中的含量都非常低,我们前期的研究中已以鸢尾苷等为定量指标进行了分析,为了更全面分析和评价葛花的质量,本研究将采用葛花黄酮类主要成分和总黄酮测定的方法对葛花进行质量评价。

本研究将以不同浓度的乙醇回馏制备葛花提取物,并采用大孔吸附树脂对其中的总黄酮进行纯化。以高效液相色谱法(HPLC)测定葛花提取物及其纯化物中鸢尾苷、6"-O-木糖鸢尾苷、染料木素 3种主要黄酮类成分的含量,并将 UV法测定的总异黄酮含量结果与 HPLC法所得结果进行比较,以优选葛花黄酮类成分的提取和纯化的工艺。

1 仪器与材料

Waters高效液相色谱系统 (含 Waters 1525泵,Waters 2487双通道紫外检测器,Waters 717plus自动进样器,Breeze色谱工作站,美国 Waters公司);Mettler Toledo AG285电子天平 (瑞士梅特勒公司);TU-1810紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司);SB25-12D超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司);电子恒温水浴锅 (广东省汕头市医用设备厂);DZF-6051型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

乙醇 (分析纯,江苏汉邦科技有限公司),甲醇、乙腈 (色谱纯,美国霍尼韦尔公司),超纯水;AB-8大孔吸附树脂 (南开大学化工厂,批号:5-1);鸢尾苷(中国药品生物制品检定所提供,批号:111632-200501),6"-O-木糖鸢尾苷 (自制,经 HPLC归一化法测定纯度为 99.1%);染料木素 (上海同田生物技术有限公司提供,批号:06070613);葛花药材 (广州市药材公司),经中山大学药学院天然药物化学王军副教授鉴定为野葛 [Pueraria lobata(W illd.)Ohwi]的干燥花。

2 实验方法

2.1 葛花提取物的制备

称取葛花药材约 10 g,精密称定,共 4份;分别采用水和体积分数比为 30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液为提取溶剂制备葛花提取物:以 100 mL提取溶剂浸泡药材 1 h后,回流提取 3次,第 2、3次分别使用 80 mL提取溶剂,每次 1 h;合并 3次滤液,旋转蒸发回收乙醇,真空干燥,得到棕黄到深棕色的细粉状葛花提取物,称重,保存。

2.2 葛花纯化物的制备

称取大孔吸附树脂湿树脂约 220 g,活化后湿法装柱;称取 1 g葛花提取物,用 20 mL纯化水溶解上柱:先用纯化水冲洗至基本无糖类物质流出,再用90%乙醇冲洗至流出液基本无色。将 90%醇洗部分的乙醇蒸干,所得浸膏真空干燥,得到细粉状提取物,称重,保存。计算提取物折合后的纯化物总重量。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取鸢尾苷、6"-O-木糖鸢尾、染料木素对照品 11.82、9.3、5.0 mg,置 50 mL容量瓶中 ,以80%甲醇溶解并稀释至刻度,制成对照品贮备液。根据测定需要精密量取对照品贮备液进行稀释,即得对照品标准系列溶液。

2.4 色谱条件

采用 GRACE C18(250 mm ×4.6 mm,5μm)色谱柱 (美国格雷斯公司),流动相:乙腈 (A)-水(B),线性梯度洗脱 (A-B:0 min 15:85;35 min 50:50;36 min 15:85;40 min 15:85;v/v);流速:0.8 mL/min;紫外检测波长:265 nm;室温。

2.5 HPLC法测定 3种异黄酮成分的含量

分别称取葛花提取物 50 mg、纯化物 12.5 mg,精密称定,分别用 80%甲醇超声溶解并定容于 50 mL容量瓶中,摇匀,微孔滤膜过滤后,取续滤液 10 μL注入高效液相色谱仪进行分析,记录峰面积。以外标法计算其中鸢尾苷和 6"-O-木糖鸢尾的含量,染料木素的含量则以其峰面积相对鸢尾苷标准品峰面积的百分比进行计算。

2.6 UV法测定葛花提取物的总黄酮含量

取浓度为 10.02μg/mL的鸢尾苷对照品储备溶液 1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL,分置于 10 mL容量瓶中,以 80%甲醇定容,摇匀,于 265 nm测定吸光度,绘制标准曲线。分别称取葛花提取物、纯化物50 mg,精密称定,以 80%甲醇超声溶解并定容于50 mL容量瓶中,摇匀,滤过,稀释适当的倍数后 (使吸光值在 0.2～0.8之间),于 265 nm测定吸光度,根据标准曲线计算其中总黄酮的含量。

3 结果与分析

3.1 葛花不同溶剂的提取和纯化结果见表1:

表1 葛花不同溶剂的提取和纯化结果

结果显示,以纯水为提取溶剂时得到的粗提物最多,90%乙醇提取物最少;但经过大孔树脂柱纯化后,所得纯化物的质量相对提取物来说大大减小,但总体相差不大;这一方面说明纯化物中确实减少了许多水溶性杂质,另一方面也说明大孔树脂的纯化基本保留了绝大部分所需要的黄酮类成分,其中以50%乙醇为提取溶剂并纯化时可得到最大的收率。

3.2 葛花黄酮类成分含量的测定

葛花 70%乙醇提取物的 HPLC色谱图见图1。鸢尾苷和 6"-O-木糖鸢尾苷的峰面积 (Y)与浓度(X)分别在 11.8～236.4和 10.33～185.99μg/mL范围内线性关系良好;回归方程分别为 Y=34920X-1156.5(r=0.999 8,n=7)和Y=30731X-216635(r=0.999 2,n=7);平均回收率分别为103.7%和 100.2%,RSD<2%(n=9)。不同葛花提取物与纯化物中 3种主要黄酮类成分的 HPLC测定结果 (占药材质量百分数)见表2。

图1 6"-O-木糖鸢尾苷、鸢尾苷与染料木素混合对照品

表2 不同葛花提取物及纯化物的 HPLC测定结果

结果表明,随着提取溶剂中乙醇质量分数的增加,提取物中 3种黄酮成分占总药材的百分数呈增加趋势,其中 50%及 70%乙醇为提取溶剂可以得到较大的收率。经大孔树脂纯化后,葛花总黄酮并无较大损失,说明该纯化方法基本保留了粗提物中的黄酮类成分。

3.3 葛花提取物经大孔树脂纯化前后的黄酮含量见表3。

表3 葛花提取物经大孔树脂纯化前后的成分比较

由表3可以看到,按归一化法计算,所测 3种黄酮的峰面积之和达到总峰面积 80%以上,为提取物中总黄酮的主要成分。经过大孔树脂纯化后,3种黄酮成分的峰面积之和百分数均有所提升,同时提取物中总黄酮的含量显著增大,均超过了 50%,说明其纯度得到了很大的提高。

3.4 UV法测定结果与 HPLC测定结果的比较

用UV法测定葛花总黄酮的含量,吸光度 (Y)与浓度 (X)在 1～10μg/mL的范围内线性关系良好;回归方程为 Y=0.0741X+0.001(r=0.999 8,n=5);平均回收率为 99.5%,RSD<2%(n=5)。UV法测定结果与 HPLC测定结果的比较见表4,测定结果以待测物占药材质量百分数表示。

表4 UV法与 HPLC法测定葛花总黄酮含量的结果比较

由表4中 UV法与 HPLC法测得结果的差值可以看出,葛花提取物中总黄酮含量在以 30%或 50%乙醇为提取溶剂时的两种方法结果差异较大,其余结果较为接近。经大孔树脂纯化后,两种方法的测定结果差异减小,说明大孔树脂可以减少干扰总黄酮测定的杂质的量。以纯化物的总黄酮为评价标准,UV法测定结果表明以 70%乙醇为提取溶剂时葛花黄酮的收率最高,而 HPLC法的结果则显示以50%乙醇为提取溶剂能得到最大的黄酮收率。

从结果还可以看出,70%乙醇提取物经大孔树脂纯化后,UV法与 HPLC法测得的总黄酮含量最为一致。而以 50%乙醇回馏提取虽能得到最大的总黄酮收率,但两种方法的分析结果差异却很大。综合上述两个定量方法的测定结果,可推断以 70%乙醇提取葛花总黄酮最为合理,在保证了较高的总黄酮收率的同时,以 HPLC法或 UV法对其进行总黄酮的含量测定也较为可靠。

4 讨 论

4.1 本研究建立了葛花药材中主要异黄酮类成分鸢尾苷、6"-O-木糖鸢尾苷与染料木素的 HPLC定量分析方法,以此法对葛花的不同浓度乙醇提取物及其大孔树脂纯化物进行了含量测定,并将该法结果与UV法测定的总黄酮结果进行了比较。结果表明,不同工艺提取的葛花提取物中异黄酮类成分有较大区别,大孔吸附树脂纯化后可显著提高总黄酮的纯度;所建立的 HPLC法准确、可靠,可用于葛花中 3种黄酮的含量测定;HPLC联合UV法可共同用于葛花的质量评价及提取工艺的研究。

4.2 HPLC分析结果显示,所测定的 3种物质为葛花中黄酮的主要成分,可作为葛花质量评价的指标物质。经大孔树脂纯化后葛花提取物的黄酮纯度增加,同时其药材中黄酮的百分数测定结果减小,说明未经纯化前的粗提物存在造成分析结果偏大的杂质。HPLC法与UV法对于不同的葛花提取物,其总黄酮的测定结果差异不等。HPLC测定结果显示,50%乙醇能得到最大的黄酮收率,与相关研究中以UV为分析方法得到的结果不同[6]。但综合两种分析方法,以 70%乙醇为提取溶剂时,不仅可以得到较高的葛花黄酮收率,其 HPLC与 UV法的测定结果差值也较小,故为提取葛花总黄酮的最佳溶剂。

4.3 国内外以 HPLC法测定葛花中黄酮类物质的报道并不多,且测定指标的选择不尽相同。国内研究方面,张淑萍等[7]采用 HPLC法测定野葛花中葛花苷、次葛花苷及尼泊尔鸢尾异黄酮含量,张国峰等[8]则以 HPLC法同时测定了野葛花中葛花苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、鸢尾黄素 -7-O-木糖葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素 A的含量。而本研究结果表明,葛花乙醇提取物中主要的异黄酮类物质为鸢尾苷、6"-O-木糖鸢尾苷和染料木素,其他成分几乎检测不到,这与一些相关报道一致[5,9]。究竟为何不同葛花样品的 HPLC成分分析结果差异如此之大,还需进一步探讨。

4.4 国内对于解酒中药葛花的提取工艺研究报道不多,国外则未见报道。杨向东等[6]以 UV为检测手段,采用正交设计法观察了回馏提取葛花总黄酮的影响因素。朱中贵等[10]考察了超声提取葛花总黄酮的影响因素。上述研究均以鸢尾苷或葛根素为对照品,以 UV法测定葛花提取物中总黄酮的含量。本研究以较为准确、可靠的 HPLC法测定葛花提取物中 3种主要异黄酮成分,并以峰面积百分数计算其中总黄酮含量;同时以 UV法测定提取物总黄酮,以两种方法综合评价最佳提取工艺,其结果更为科学合理。

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