＊ 甲烷利用克雷伯氏菌M E17菌株培养参数优化研究

赵翠翠,郑 军,赵艮贵

(山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西太原 030006)

＊甲烷利用克雷伯氏菌M E17菌株培养参数优化研究

赵翠翠,郑 军,赵艮贵＊

(山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西太原 030006)

利用响应面分析法对克雷伯氏菌菌株M E17的液体培养条件进行了优化,研究了温度、接种量、甲烷含量和培养基p H对菌株M E17生长的影响.在单因素实验的基础上,利用Box-Benhnken设计和响应面分析法对培养温度、接种量和甲烷含量进行分析,得到最佳培养条件为:p H 6.0,培养温度24.4℃,接种量6.7%,甲烷含量25%.在优化培养条件下,细菌生物量约是初始培养条件下的1.7倍,延滞期缩短45 h.该菌株初步应用于甲烷气体的脱除,脱除率达84.7%,表明该菌株在优化培养条件下能良好地脱除空气中的甲烷气体.

克雷伯氏菌;响应面法;甲烷脱除率

甲烷(CH4)是煤矿瓦斯、煤层气以及垃圾堆放产生的主要气体[1],也是温室效应气体的主要成分,其排放量占温室气体总排放量的16%.等量CH4对大气臭氧层的破坏能力约为CO2的7倍,造成的温室效应约是CO2的21倍[1-3].因此,快速检测甲烷的产生源、泄露源及在环境中的含量有十分重要的意义,但由于甲烷理化性质极不活泼,准确、快速地检测甲烷已成为世界性难题.

在常温、常压和有氧条件下,甲烷氧化菌(Methanotrophs)可利用胞内单加氧酶系催化转化甲烷[4].关于甲烷氧化菌的研究目前主要集中在该类微生物特性、氧化作用机理等方面,也有用甲烷氧化菌生产单胞蛋白、转化煤矿瓦斯气体[1]和降解三氯乙烯(TCE)[5]以及微生物传感器等应用研究的报道[6-8].为了更好地挖掘这一微生物资源,本课题组从稻田土壤中分离得到一株新型的能利用甲烷的克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)M E17菌株,并利用该菌株为识别元件开展了甲烷微生物传感器的研究[9,10].为了更好地利用该菌株,提高菌体生物量是前提.本文采用响应面法(RSM)优化了M E17的主要培养参数,并在优化条件下测定了该菌株去除甲烷气体的能力,为进一步利用该菌株为识别元件制备微生物传感器以及甲烷治理等应用奠定基础.

1 实验部分

1.1 菌株与主要试剂

克雷伯氏菌M E17,其16Sr DNA序列 Gen Bank登陆号为 EU 154478,本室分离、保存.甲烷气体:纯度99.99%,太原钢铁集团提供.

1.2 方法

1.2.1 培养基配制和培养方法

无机盐培养基配方和配制按文献[9]方法进行.在盛有100 m L无机盐培养基的600 m L培养瓶中,气相部分充入体积分数10%甲烷气体,置于120 r/min振荡摇床,30℃进行细菌培养.

1.2.2 菌体生长量的测定

以600 nm菌体的吸光度(OD600nm)表示菌体的生物量.8 000 r/min离心10 min,弃上清,无菌水洗涤两次再定容至原体积,以不接种的培养基为对照,在1 cm比色杯中于分光光度计上测定OD600nm.

1.2.3 单因素试验

用OD600nm约为0.1的纯培养物为菌种,按5%的接种量接种于液体无机盐培养基中,气相部分含有一定量的甲烷,对温度、接种量、甲烷含量和培养基p H等因素进行初选.实验重复3次,取平均值分析.

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上,根据Box-Benhnken设计原理,进一步进行3因素3水平的响应面分析试验,实验设计见表l.以培养温度、接种量和甲烷含量为自变量,以菌体生物量为响应值进行响应面试验.

表1 培养条件的响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface

1.2.5 数据处理

用SAS软件[11]进行多元二次回归模型方程的建立,并作出响应面图,进一步通过数据优化程序,求得当响应面值最大时,培养基各成分的最优水平.

1.2.6 甲烷利用能力的测定

在优化条件下观察了该菌株在培养过程中对CH4利用能力.分别在不同培养时间从培养瓶气相中取样10μL于 GC9800(上海科创色谱有限公司)型气相色谱仪检测CH4含量,检测器为氢火焰检测器,按外标法以峰面积计算CH4含量.同时设置三组平行实验.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

温度、接种量、CH4含量和培养基p H对菌株生长的影响见图1.培养170 h,温度、接种量、CH4含量和培养基p H对菌株的生长都有明显影响.结果表明:培养温度25℃,接种量10%,CH4含量25%,p H 6.0菌株M E17生长良好.选择培养基p H为6.0,对培养温度、接种量和CH4含量进行响应面实验设计优化.

图1 温度、接种量、甲烷含量和p H对菌株M E17生长的影响Fig.1 Effects of temperature,inoculum volume,methane content and p H on grow th of M E17

2.2 菌株M E17培养条件的响应面优化

菌株M E17响应面分析实验设计和测定数据见表2(P455).利用SAS软件对表2数据进行二次多元回归拟合,回归分析见表3(P455),得出培养温度(X1)、接种量(X2)、CH4含量(X3)与菌体生物量(OD600nm)的二次多项回归方程为:

Y=0.142 667-0.005 25X1-0.010 75X2-0.019 583X1X1-0.033 583X2X2-0.038 003X3X3,

复相关系数R2=0.9824.从回归分析表中可以看出,回归方程的一次项和二次项的影响都是显著的,说明各具体因子对响应值的影响不是简单的线性关系;交互项作用影响不显著,故省略交互项.

通过回归方程绘制分析图,考察所拟合的响应曲面图(见图2).可见拟合曲面有最大值.对拟合方程进行偏导求解,可得模型极值点,即为最佳培养条件.根据解析结果分析:培养温度为24.4℃,接种量6.7%(约7%),CH4含量为25%时,其理论最大生物量OD600nm值为0.143.为检验 RSM的可靠性,进行了优化培养条件和初始培养条件的比较.

表2 菌株M E17响应面分析实验设计及结果Table 2 Experimental design and results of RSM of M E17

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis of ME17

2.3 生长曲线的测定

菌株M E17在优化条件和初始培养条件下的生长曲线见图3,可以看出细菌在两种不同培养条件下生长曲线明显不同.与初始培养条件相比,在优化条件下,延滞期缩短45 h,细菌生长速率快,最大生物量OD600nm值达到0.145,与回归方程预测值相吻合,约是初始培养条件的1.7倍.经条件优化,大幅度提高了菌体的生物量,并缩短了培养周期24 h.由于该菌株能够利用CH4,进一步观察了该菌对CH4的利用情况.

2.4 利用甲烷能力的测定

利用气相色谱测定不同培养时间培养瓶气相中CH4含量见图4.培养瓶中的CH4含量随着培养时间的延长明显降低,培养7 d,培养瓶中的甲烷减少了约84.7%.结果表明:该菌株对空气中的CH4有较好的脱除率.

图2 X1(培养温度)、X2(接种量)和 X3(CH4含量)交互响应面图Fig.2 Response surface chart of X1(temperature),X2(inoculum volume)and X3(methane content)

图3 菌株M E17在不同培养条件下的生长曲线Fig.3 Effect of different cultivation on cell grow th of strain M E17

图4 不同培养时间菌株M E17对CH4的利用Fig.4 Methane utilization of strain M E17 at different incubate time

3 讨论

CH4是煤矿瓦斯的主要成分,易燃易爆,常造成煤矿的重大灾害,也是温室气体的主要成分,因此如何处理和调控CH4已经成为当前研究热点.本课题组已利用菌株M E17作为识别元件开展了微生物传感器的研究[9,10],但该菌培养时间较长,菌体的生物量较低,难以满足应用的要求.因此,本文选择了响应面优化法,对影响该细菌生长的主要因素进行了优化,其最佳培养参数为:p H 6.0,培养温度24.4℃,接种量6.7%,CH4含量25%.为了检验RSM的可靠性,进行了优化条件和初始培养条件的比较,经过优化,菌体生长延滞期缩短、生长速率快、生长期缩短,最大生物量提高,约是初始培养条件的1.7倍.

由于CH4难溶于水,该菌株虽然培养时间较长,生物量较低,但与初始条件相比已有大幅度改善.而使用其他碳源培养,生物量和培养周期均令人满意,但CH4利用能力会大幅度降低.同时,该菌株对含有10%甲烷的空气中CH4的脱除率达到84.7%,具有较高的脱除能力.因而该菌株具有煤矿以及垃圾填埋释放CH4的治理的应用潜力.但是,如何提高具有高活性利用CH4的CH4氧化菌的生物量[12],还需要从菌种改造以及培养条件优化两方面进行深入的研究,以满足实际应用的需求.

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Optimization of Liquid Fermentation Condition for Methane Utilizing Klebsiella sp.M E17

ZHAO Cui-cui,ZHENG Jun,ZHAO Gen-gui
(Institute of Biotechnology,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of the Ministry of Education,Shanxi University,Taiyuan030006,China)

The optimization of liquid fermentation condition forKlebsiellasp.M E17 was analyzed by response surface method,and the effects of temperature,inoculum volume,methane content and initial p H of media on the cell grow th were studied.Based on the single factor experiments,the temperature,inoculum volume and methane content w ere analyzed by Box-Benhnken design and response surface method.The optimum conditions w ere as follow s:p H 6.0,temperature at 24.4℃,inoculum volume 6.7%and methane content 25%.Under the optimal culture conditions,the M E17 production was increased to 1.7 times and its log phase was reduced for 45 h than preliminary culture.The removal of methane gas by M E17 was preliminary investigated and the removal rate of methane gas reached 84.7%.The results indicated that the strain which was acclimated on the optimization of liquid fermentation condition was capable of removing of methane.

Klebsiella;RSM;methane

Q 93

A

0253-2395(2010)03-0453-05＊

2009-09-24;

2009-12-30

国家自然科学基金重点项目(50534100)

赵翠翠(1985-),女,山西临汾人,硕士研究生,研究领域:微生物学.＊通讯作者:又名赵春贵,E-mail:chungui@sxu.edu.cn