生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中三种酶活性的影响

康照昌 李玉荣 敖明章 (湖北职业技术学院护理学院,湖北 孝感 432000)

随着现代航天航海事业的发展,世界各国都在开展运动病的研究工作,对防治运动病的研究已经取得了一定的成果,但尚无公认的疗效确切、副作用少的治疗措施。寻找更为有效、更安全的抗运动病方法日益引起国内外重视。目前的抗运动病药物主要包括抗胆碱、抗组胺类及拟交感胺类等,虽有一定的抗运动病作用,但多有中枢抑制作用,限制了其临床使用。而我国自古就应用中草药生姜抗眩晕病,生姜有确切的抗运动病防止晕车、晕船的作用〔1〕。美国科学家也证明生姜确有防晕船等效果〔2〕,且相对其他防晕船药物相比,无口干,昏睡,血压降低等副作用。近年来,国内学者进行的动物实验证实,生姜的有效成分有明显的止吐抗运动病的作用〔3〕,且无明显副作用。南通医学院航海医学研究所与南通市中医院联合研究的生姜合剂由生姜、半夏等 6味中药组成〔4〕,及单独的生姜粉等用于防治运动病,效果较晕海宁强,副作用不明显,因而生姜成为各国学者普遍看好的新的抗运动病药物。本实验运用乙醇法提取生姜有效成分,将其与透皮剂氮酮混合制成帖剂贴在运动病大鼠的脐部〔5〕,测定大鼠大脑皮质、小脑皮质、脑干前庭区脑细胞中 Na+-K+-ATP酶、碱性磷酸酶 (ALP)、细胞色素氧化酶 (CCO)活性变化〔6〕,透皮疗法使药效发挥更加持久,而且方法简便,作用迅速〔7〕,为抗运动病新型药物的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性 SD大鼠 40只、体重 (200±10)g,购自湖北省实验动物中心,动物合格证号：SYXK(鄂)2003-0007,检疫后备用。单笼饲养,自由摄食水,饲养 1 w后开始实验。随机分 5组,分别是正常组、模型组和生姜高、中、低剂量组,每组 8只。模型组和生姜组大鼠脐部脱毛,每天将透皮贴贴在脐部,给药 30 min。随后给予 2 h的运动病刺激：将大鼠无束缚地放入旋转装置中的有机玻璃笼内,先顺时针方向加速度从16°/S2加速至 120°/S2,然后立即以 45°/S2减速至 0,马上逆时针再以 16°/S2加速至 120°/S2,然后以 45°/S2减速至 0,如此反复。旋转时间为 2 h〔8〕,除正常组不接受旋转刺激外,其他各组处理相同,旋转刺激完成后动物放回饲养笼中。连续刺激 3 d,1次 /d。每天观察动物接受刺激后的反应情况,第 3天刺激结束后取动物迅速断头处死,冰上迅速分离脑组织,取出大鼠三部位脑组织,放入液氮,转入 -80℃冰箱备用。

1.2 药品与材料 生姜透皮贴：生姜 (华中科技大学鉴定)清洗去杂切碎,双蒸水浸泡,闪式提取器提取,过滤,滤液减压浓缩至浸膏状,按 50、100和 200 mg/kg将生姜浸膏与氮酮混匀,制成 3 cm×4 cm生姜透皮贴,另用氮酮制作空白贴剂供模型组使用。ALP试剂盒 (批号：060101)、Na+-K+-ATP酶试剂盒(批号：060101)、CCO试剂盒 (批号：060101)均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验仪器 低温高速离心机 (Backman)、电热恒温水温箱 (上海医疗器械七厂)、721分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)。

1.4 酶细胞化学反应 将组织用含 2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸钠缓冲液固定液 (pH1.4 0.1 mol/L)4℃固定1 h。二甲砷酸钠缓冲液漂洗后,与液氮冷冻后两组样品并列放在一起,恒冷箱冷冻切片为 10μm,分别测定进行 Na+-K+-ATP酶、ALP和 CCO〔9〕。用 1%锇酸固定 1 h,EPON812包埋,LKB超薄片机切片,不进行电子染色,直接在 H ITACH I-H300型电镜下观察。

1.5 酶活性定量分析 采用 XY-540型彩色图像分析系统定量分析〔10〕,128×128像素点,每张切片随机测 5次,酶切片反应至少测 30次,以阳性反应面积 (单位为μm2)作为酶反应强度的参数,取其平均值。

2 结 果

2.1 一般情况 大鼠受到运动病刺激后,自发活动明显减少,皮毛蓬松耸立,排尿排便增多。运动病刺激结束后大鼠行为表现有所恢复,约 3 h后开始活动或进食。与正常组比较,生姜组和模型组大鼠消瘦,进食量未见明显改变。

2.2 各组大鼠大脑皮质三种酶活性 运动病大鼠大脑皮质Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小,ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠大脑皮质中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显增大,ALP阳性反应面积减小,见表1。

表1 大鼠大脑皮质三种酶活性的图像定量分析(±s,n=8)

表1 大鼠大脑皮质三种酶活性的图像定量分析(±s,n=8)

与正常组比较：1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较：3)P＜0.05,4)P ＜0.01,下表同

组别 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常组 90.324±23.302 100.483±71.119 59.817±14.909模型组 37.531±17.1522) 50.737±33.9712) 125.639±85.3321)生姜低剂量组 60.308±3.390 80.694±41.572 68.535±12.109生姜中剂量组 61.255±19.2794) 81.699±51.5744) 66.219±43.1063)生姜高剂量组 59.557±21.321 80.991±22.191 68.569±31.925

2.3 各组大鼠脑干前庭区三种酶活性 运动病大鼠脑干前庭区中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小,ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠脑干前庭区中 ALP、Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大,ALP阳性反应面积减小,见表2。

表2 大鼠脑干前庭区三种酶活性的图像定量分析(±s,n=)

表2 大鼠脑干前庭区三种酶活性的图像定量分析(±s,n=)

组别 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常组 70.686±15.341 151.649±10.249 98.633±49.102模型组 40.464±17.9912) 52.526±22.3472) 258.361±112.0091)生姜低剂量组 59.819±26.337 93.389±55.001 156.221±19.991生姜中剂量组 61.229±23.3694) 96.991±71.0264) 160.669±79.9123)生姜高剂量组 58.321±19.029 94.258±38.034 156.631±87.567

2.4 各组大鼠小脑皮质三种酶活性 运动病大鼠小脑皮质中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小,ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠小脑皮质区中 ALP、Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显增大,ALP阳性反应面积减小 ,见表3。

表3 大鼠小脑皮质三种酶活性的图像定量分析(±s,n=8)

表3 大鼠小脑皮质三种酶活性的图像定量分析(±s,n=8)

组别 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常组 118.629±79.930 141.594±96.021 50.378±11.102模型组 0.534±12.2362) 62.632±51.0192) 82.826±15.9811)生姜低剂量组 81.265±19.556 93.559±47.108 63.676±17.438生姜中剂量组 85.335±31.4414) 95.173±33.1154) 66.779±26.1133)生姜高剂量组 80.081±55.147 94.250±19.902 62.551±36.775

3 讨 论

大脑和小脑皮质及脑干前庭区等中枢对运动病的发病有关〔11〕。ALP和 Na+-K+-ATP酶反应产物主要定位于以上三部位毛细血管内皮细胞膜上,也呈阳性反应。CCO反应产物主要定位于以上三部位脑细胞线粒体膜上。

旋转刺激可引起神经细胞膜 Na+-K+-ATP酶活性下降,ALP活性上升,线粒体 CCO活性下降。这可能表明旋转刺激引起 Na+-K+泵效率明显下降,导致细胞膜外 K+浓度上升,高浓度 K+可打开神经细胞膜上电压依赖性 Ca2+通道,导致 Ca2+内流。神经细胞膜外高 K+和细胞内高 Na+浓度梯度是引起Ca2+内流和神经细胞兴奋性降低的一个重要因素,ALP活性上升可能与膜的通透性增加有关,同 Ca2+内流亦相关。CCO活性降低同有氧代谢水平降低有关,这可能是脑血流量减少的一个重要因素〔12〕。

何丽娅〔13～15〕等在家兔急性完全脑缺血再灌注模型上观察生姜的脑复苏效应,显示生姜提取液能抑制脑组织脂质过氧化产物MDA的生成,提高脑组织中 SOD活性和 Na+-K+-ATP酶活性,能有效地保护缺血再灌注大脑的过氧化氢酶活性,同时改善缺血组织代谢和缺氧状况,明显改善细胞膜上 Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-ATP酶活性。

本实验应用组织化学定位方法和图像定量分析方法,研究表明,旋转刺激可引起大脑和小脑皮质及脑干前庭区神经细胞Na+-K+-ATP酶活性下降,ALP活性上升,线粒体 CCO活性下降。用生姜透皮贴后,运动病大鼠三种脑组织ALP活性显著减低、Na+-K+-ATP酶及 CCO活性明显升高。

综上所述,生姜提取物制成透皮贴可能通过改善脑血流分布,调整细胞内 CCO、ALP、Na+-K+-AT酶和 ALP等一系列酶活性,增强脑细胞的兴奋性,从而保持中枢神经系统兴奋性,起到抗运动病的作用。

尽管近年来对运动病发病机制有了较多较深入的认识,但要清晰地阐明运动病发生的神经通路仍有待深入的研究。随着航空航天事业的发展,运动病的预防和治疗已成为神经科学、军事医学及临床医学的重要研究课题之一〔16〕。目前对于生姜的有效成分的提取,化学成分分析,药理作用研究和临床应用等方面,均取得了较大进展。本实验使用生姜提取物制成的透皮贴,它具有吸收快、药效持久释放、作用效果好且无副作用等特点,为运动病的防治提供了很好的思路,为研制新型抗运动病药物提供实验依据,下一阶段将使用生姜透皮贴运用于预防和治疗运动病人的实验研究,将为运动病人带来福音。

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