黑籽南瓜离体再生体系与转基因技术研究

李长生　赵传志　李爱芹　夏　晗

摘要：以黑籽南瓜为试验材料，子叶为外植体，建立了黑籽南瓜组织培养再生体系，并对转基因常用的抗生素浓度进行了筛选。试验结果表明：萌发4天的子叶是诱导芽再生的最佳外植体，MS+1.0mg／L BA是诱导芽再生的最适培养基，1／2MS+0.5mg／L GA₃是适合再生苗壮苗和生根的培养基。100mg／L卡那霉素、50ms／L潮霉素适于南瓜的转基因，初步的转基因研究验证了此转化体系的有效性。

关键词：黑籽南瓜；组织培养；转基因

中图分类号：S642.903.6文献标识号：A文章编号：1001-4942(2009)07-0008-04

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouche，)属于葫芦科南瓜属。栽培南瓜及其野生近缘种均起源于美洲，广泛分布于世界各地，我国栽培的南瓜属植物主要有美洲南瓜、印度南瓜和中国南瓜。南瓜属植物不仅是重要的蔬菜来源，还具有保健和观赏作用。黑籽南瓜是南瓜属中种子为黑色的栽培种，染色体数2n=2x=40，起源于中美洲的高原，现分布于墨西哥中部、中美洲至南美洲智利的广大地区，果实产量高，是优良的饲料。黑籽南瓜生长势强，生长要求温度低，其根系在较低的地温下伸长能力强，发育良好，对葫芦科蔬菜枯萎病抗性强，嫁接亲和性好，是嫁接黄瓜的常用砧木。

虽然黑籽南瓜作为砧木能够在很大程度上减少土传病害，但随着保护地面积的扩大，规模化种植和连作的加重，土传病害(如黄瓜枯萎病、疫病等)的变种激增，新病害不断出现，防治难度加大。调查发现，当前大棚土传病害已上升为主要病害。对寿光市170栋大棚蔬菜随机调查发现，土传病害发生严重的占73.2％，其中根结线虫发生严重和较严重的占42.5％；对济源市2500栋温棚蔬菜调查显示，每年都发生土传病害的占95％，其中根结线虫占35％；中等程度发生的占52.5％，严重发生的占23.4％。目前我国设施蔬菜病害仍以化学防治为主，过量、频繁施用化学杀菌剂的现象普遍存在，对土壤环境危害严重。近年来，生物工程方法在作物病害防治领域得到广泛应用，并取得了良好的效果，利用转基因方法将抗病基因转入黑籽南瓜，既能提高其抗病性，又不会将外源基因转入黄瓜。稳定的离体再生和转化系统是基因改良黑籽南瓜品种的前提，虽然南瓜的组培体系已有报道，但其再生频率仍然较低，且不同南瓜栽培种的离体再生条件不尽相同。本研究以砧木用黑籽南瓜子叶为外植体，对影响其再生的激素种类及其浓度进行筛选，并在此基础上将带有潮霉素抗性标记的植物表达载体成功转入黑籽南瓜，对利用转基因方法改造黑籽南瓜的抗病性做了有益探索。

1材料与方法

1.1材料

挑选饱满的黑籽南瓜种子，蒸馏水中浸泡30min，剥去种皮，70％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗2次，2.5％次氯酸钠灭菌15min，无菌水冲洗3次以上，在无激素的1／2MS培养基上培养，培养温度为(26±2)℃，培养3～8d，以发芽的种子制备外植体。

1.2方法

1.2.1黑籽南瓜离体再生体系的建立以MS为芽再生的基础培养基，NAA设0、0.02、0.05、0.1mg／L四个浓度，BA设0.5、1、4 mg／L三个浓度，筛选最合适芽诱导的培养基。以1／2MS为再生芽生根的基础培养基，配合NAA和GA₃，筛选最适合根诱导的培养基。

1.2.2黑籽南瓜外植体对常用转基因标记抗生素浓度敏感性筛选对常用的转基因再生苗抗生素筛选标记进行外植体敏感性试验，筛选适宜的抗生素浓度，其中卡那霉素设50、100、150mg／L三个浓度，潮霉素设20、30、50、80mg／L四个浓度，添加到芽诱导培养基中，观察芽再生情况和外植体的反应。

1.2.3黑籽南瓜转基因技术体系将带有潮霉素抗性筛选标记的植物表达载体pCAMBIA1381z转入农杆菌菌株C58C1，子叶在过夜培养的农杆菌中浸泡10min，用无菌滤纸除去多余菌液，将子叶置于芽诱导培养基上暗培养2天，外植体转移到添加30mg／L潮霉素和200mg／L头孢霉素的芽诱导分化培养基上。潮霉素抗性再生苗经壮苗和生根后，取叶片提取DNA进行PCR扩增，检测潮霉素抗性基因。

2结果与分析

2.1黑籽南瓜外植体离体再生情况

取萌发3～7天的无菌子叶，从叶柄处切断，将子叶横向一分为二，置于分化培养基上，10天后子叶膨大，在伤口处出现愈伤组织(图1A)；20天后在愈伤组织附近出现再生芽(图1B)或再生根。在萌发3～7天的子叶中，发现萌发4天刚刚开始变绿的子叶分化能力最强，出愈率达到100％，芽分化率达到60％以上，而其它发育时期子叶外植体芽分化率在40％以下。对外植体愈伤组织发生位置的观察发现，子叶切口处均有愈伤组织，但只有靠近叶柄处的愈伤组织能够再生出芽，故在后续试验中采用萌发4天的子叶作为外植体，外植体切割时留有小段叶柄。

2.2黑籽南瓜离体再生体系的建立

由表1可看出，在MS基本培养基上，当BA浓度为1.0mg／L时，随着NAA浓度的增大，黑籽南瓜子叶再生芽频率呈逐渐降低趋势，且不添加NAA的处理其不定芽再生率最高(66.7％)；当BA的浓度大于或小于1.0mg／L时，黑籽南瓜不定芽再生率均为0。可见，最适合黑籽南瓜芽再生的培养基为MS+1.0mg／LBA。

另外，试验还发现，适合黑籽南瓜再生苗生长的基础培养基为1／2MS培养基，最适合其根诱导和壮苗的培养基为1／2MS+0.5mg／LGA₃，再生苗可以在不添加生长素类激素的1／2MS培养基上正常生根(图1C)。

2.3常用抗生素对黑籽南瓜外植体再生的影响

选用转基因常用的潮霉素、卡那霉素，观察不同抗生素对黑籽南瓜外植体植株再生的影响。结果(表2)表明，在添加20、30mg／L潮霉素或添加50mg／L卡那霉素的分化培养基上，大部分外植体可以形成愈伤组织，出愈率达到90％以上；在50mg／L潮霉素或100mg／L卡那霉素的培养基上，外植体出愈率降低，少数外植体分化出黄化再生芽；在80mg／L潮霉素或150mg／L卡那霉素的培养基上，个别外植体能形成愈伤组织，大部分外植体在培养2周后枯萎死亡。可见，可选用50mg／L的潮霉素和100mg／L卡那霉素作为黑籽南瓜转基因筛选的高限临界浓度。

2.4黑籽南瓜转基因体系的建立

采用以上筛选出的再生体系作为黑籽南瓜转基因的基础。将带有潮霉素抗性筛选标记的植物表达载体pCAMBIA1381z，转化农杆菌C58C1，侵染外植体，在分化培养基上以50mg／L的潮霉素筛选转基因植株，以200mg／L的头孢霉素作为抑菌素，培养20天后，分化出再生芽。再生芽长到1cm时转入壮苗和生根培养基，2周后在幼苗上剪取叶片提取DNA，用潮霉素抗性基因引物检测转基因植株。9株再生苗中，阳性为2株，弱阳性5株(图2)。

3讨论

与其它植物一样，南瓜属植物也可以通过胚状体和器官发生两种途径进行离体再生，但南瓜属植物种和品种的多样性使得其离体再生的条件差异较大，但目前南瓜的离体再生多采用子叶为外植体。本试验结果表明，黑籽南瓜不同苗龄的子叶分化能力也不相同，以萌发4天，颜色开始变绿的子叶分化能力最强，这与其他研究者的结论相同。这可能是由于南瓜子叶在种子萌发过程中内源激素浓度变化显著，而外植体内源激素浓度和比例与其分化能力密切相关。

有研究表明，中国南瓜诱导再生芽的过程需要BA的作用，但0.5-2mg／L的BA对其芽的诱导没有很大区别，黄狼南瓜和锦粟2号南瓜的芽诱导和根诱导过程则需要分裂素和生长素的共同作用。本研究发现，黑籽南瓜诱导再生芽的最适培养基为MS+1.0mg／LBA，不需要NAA等生长素的配合，在子叶分化芽的过程中常常伴有根的分化，或只分化出根，说明外植体内源生长素积累较多，需要外加分裂素调节诱导芽的再生。同样，在壮苗及生根培养基中也不需要生长素的配合，GA₃在培养后期起到促进芽伸长的作用。初步转基因试验表明，此再生和转基因体系为基因工程改良黑籽南瓜种质打下了基础。