黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件初探

刘 辉，冯常辉

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州434025)

黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件初探

刘 辉，冯常辉

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州434025)

采用黑曲霉(Aspergillusniger)液体发酵生产纤维素酶，研究了碳源、氮源、培养基起始pH对该菌株产纤维素酶活力的影响。结果表明，在温度30 ℃、pH5.5下培养120 h的条件下确立了产酶最佳培养基是6%的稻草粉、1%的黄豆粉,其纤维素酶的最高产量是89.2 U/mL。

黑曲霉(Aspergillusniger)；纤维素酶；液态发酵

随着全世界能源危机、粮食危机、环境污染等问题的日趋严重,纤维素酶的研究和开发利用再次成为人们关注的热点。纤维素酶的应用已从传统的医药、食品深加工、饲料[1]、饮料、酒、酱油和食醋酿造等行业,扩展到单细胞发酵、纺织工业、造纸工业、环境污染治理等新领域[2]。然而,目前纤维素酶生产的菌株,绝大多数集中于木霉,而木霉的发酵产物中存在多种毒素,纤维素酶系仍欠齐全[3],致使纤维素酶的应用受到限制。人们应用激光诱变技术[4],筛选到一系列有生产潜力的黑曲霉菌株,综合测定表明其中有些菌株比较理想，能产生纤维素酶。本研究对黑曲霉发酵的产酶条件和最适作用条件进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 菌种 黑曲霉3275，由长江大学生命科学学院微生物实验室优化选种。

(2)培养基 斜面培养基：PDA培养基；种子培养基：葡萄糖3%、麸皮1%、(NH4)2SO40.15%、pH5.5～6.0；发酵培养基：稻草粉6%、黄豆粉1%、KH2PO40.45%、CaCl20.25%、pH5.5～6.0。

1.2 方法

(1)纤维素酶液体深层发酵 将新鲜的斜面菌种的孢子接入种子培养基。30 ℃、摇床上培养48 h后，按10%的接种量接入产酶培养基中进行发酵试验，摇床150 r/min，30 ℃下培养120 h停止发酵。

(2) 酶活力的测定 羧甲基纤维素酶(CMCase)的活力测定：DNS法[5]。取0.5 mL稀释了25倍的酶液，加入0.5%的CMC溶液2.5 mL，在50 ℃下酶解反应0.5 h，加入6 mL DNS试剂。然后沸水浴10 min，显色测出还原糖量。对照葡萄糖标准曲线计算出酶活力，酶活力单位定义为1 h水解生成1 mg葡萄糖的酶量为1个活力单位。

(3)pH对菌株生长影响的测定 在温度30 ℃下, 以pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5条件下测定酶活力D260值。

(4)最佳培养基材料的测定 在温度30 ℃和最佳pH条件下，碳源的浓度定为6%，以稻草粉、米糠、麸皮、甘蔗渣为原料进行优化选择；氮源浓度定为1%，以(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl、蛋白胨、黄豆粉、酵母膏和NH4NO3进行优化选择。

(5)培养基正交实验 根据预备实验，设计2因子4水平的正交试验(表1)，在温度30 ℃下进行培养基的正交实验。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖溶液浓度y=1.462 8x+0.046 9。式中，y代表相当葡萄糖量,mg/mL；x代表酶解反应产物溶液经显色后所测的光密度值。酶活力计算公式为CMCase =(y/25)×9×25×(1/0.5)×(1/0.5)。

2.2 培养基起始pH对产酶的影响

图1 培养基起始pH对酶活力的影响Figure 1 Effect of the original pH on CMCase activity

图2 碳源对产酶活力的影响Figure 2 Effect of the carbon material on CMCase activity

研究不同起始pH对此株黑曲霉产纤维素酶的影响，pH的调节用0.1 mol/L盐酸或0.1 mol/L NaOH。结果见图1。图1表明，该菌株在pH5.5～6.0时产生的酶活力高而且酶活稳定。若初始pH低于5.5时，酶活明显降低，当pH高于6.0时，CMCase酶活呈下降趋势。

2.3 碳源对产酶活力的影响

纤维素酶是一种诱导酶[6]，不同的碳源对纤维素酶的合成具有显著的影响，因此试验了一系列碳源对黑曲霉发酵产纤维素酶的影响，此时碳源的浓度定为6%，用1%黄豆粉作氮源，结果见图2。由图2可知，以稻草粉为碳源时CMCase最高，以麸皮、米糠、甘蔗渣为碳源时酶活力稍微低些。因此选用稻草粉为碳源进行发酵实验。

2.4 氮源对产酶活力的影响

用7种不同的氮源进行发酵试验，此时氮源浓度定为1%，用6%稻草粉作碳源，酶活测定结果见图3。结果表明不同氮源产酶活力大小顺序是黄豆粉、酵母膏、蛋白胨、无机氮源。使用无机氮源时，生长情况较差，酶活较低。当用黄豆粉作氮源时，对菌株生长和产酶都有促进。

图3 氮源对产酶活力的影响Figure 3 Effect of the nitrogen material on CMCase activity

2.5 培养基氮碳源用量对酶活力的影响

用稻草粉为碳源、黄豆粉为氮源的二级发酵试验中，稻草粉、黄豆粉不同比例组合对纤维素酶活性影响较大(表1)。当稻草粉为6%、黄豆粉为1%时，MCase酶活最高。因此本实验用6%稻草粉、1%黄豆粉作为发酵培养基。实验中发现无机盐以KH2PO4和CaCl2的用量对酶活性影响较大。有关文献报道[8]KH2PO4用量是0.45时，CaCl2是0.25时生长状况良好。

表1 正交试验结果Table 1 The results of or thogonal experiment

3 结论

纤维素酶是诱导酶，培养基中纤维素的含量直接影响纤维素酶的产生，因此本实验对其碳源作了大量摸索，结果发现纤维性碳源稻草粉、麸皮、玉米芯粉、玉米秸秆都是较好的碳源，与已报道的研究结果一致[7]，可溶性碳源葡萄糖和纤维二糖也是较好的碳源，但总的来说纤维性碳源比可溶性碳源要好一些[8]。由于稻草粉含有丰富的纤维素，价格便宜且来源广泛，并且通过实验表明稻草粉是生产纤维素酶培养基良好的碳源。

用稻草粉作碳源时，由于稻草粉比容较大，因此难以进行高浓度发酵。对黑曲霉进行的液体发酵条件的研究结果表明：以6%的稻草粉、1%的黄豆粉，pH保持5.5～6.0，配以0.45%的KH2PO4和0.25%的CaCl2无机盐作为摇瓶发酵培养基，可以得到较高的纤维素酶活性。利用上述培养液，在30 ℃下摇床培养120 h产酶活性最高，CMCase活性是89.2 U/mL。

[1]Walsh G A, Power R F,Headon D R.Enzymes in the animal-feed industry[J]. TIBTECH, 1993,11:424～430.

[2]Beguin P. Molecular biology of cellulose degradation[J]. Annu Rev Microbiol, 1990,44:219～248.

[3]王 沁,赵学慧.黑曲霉纤维素酶的研究[J].工业微生物,1992,22(5):20～23.

[4]赵小立,贺筱蓉,周红军,等.黑曲霉产纤维素酶菌种的激光选育[J].中国激光,1996, 23(7):667～672.

[5]蒋传葵.工具酶活力测定[M].上海:上海科学技术出版社,1982.80～87.

[6]舒远才，张运强，周金燕，等.纤维素酶的液体发酵[J].纤维素科学与技术，1994，2(3)：83～87.

[7]梁 霆,王 遂,莫志忠,等.纤维素酶液体深层发酵条件的研究[J].生物技术,1997,7(6): 22～26.

[8]汪世华,胡开辉,黄碧芳,等.黑曲霉2446产纤维素酶液体发酵条件的研究[J].江西农业大学学报,2005,27(3):466～468.

2008-11-04

刘 辉(1977-)，男，湖北武汉人，理学硕士，讲师，现从事分子生物学研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.016

TQ920.1

A

1673-1409(2009)03-S050-03