埃罗替尼对胰腺癌细胞BxPC3生长的影响及其机制

陆颖影 靖大道 王兴鹏 吴恺

·论著·

埃罗替尼对胰腺癌细胞BxPC3生长的影响及其机制

陆颖影 靖大道 王兴鹏 吴恺

目的观察表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂埃罗替尼对体外培养的胰腺癌细胞BxPC3生长的影响，并探讨其作用机制。方法应用MTT法检测埃罗替尼作用后BxPC3细胞的增殖情况；用流式细胞分析、透射电镜和原位末端标记(TUNEL)法观察细胞凋亡和细胞周期的变化；RT-PCR法检测细胞bcl-2、bax、bcl-xl、bak mRNA表达。结果埃罗替尼呈剂量和时间依赖性抑制BxPC3细胞生长。72 h后，1、100 μmol/L的埃罗替尼处理组细胞存活率分别为(90.25±2.62)%和(40.75±2.98)%，两者比较具有统计学意义(Plt;0.01)。50 μmol/L埃罗替尼处理BxPC3后24、96 h的细胞存活率分别为(74.0±4.08)%和(49.50±1.29)%，两者比较也具有统计学意义(Plt;0.01)。50 μmol/L埃罗替尼处理组的细胞凋亡率为(11.0±1.1)%，显著高于对照组的(6.2±1.1)%(Plt;0.01)；G0/G1细胞占(73.4±1.3)%，也显著高于对照组的(63.3±1.0)%；透射电镜可见细胞呈现明显凋亡形态，并见凋亡小体形成。埃罗替尼处理组细胞bcl-2、bcl-xl mRNA表达下调，bax mRNA表达轻微上调，bak mRNA的表达不受影响。结论EGFR抑制剂埃罗替尼体外可抑制胰腺癌细胞系BxPC3的生长，其机制可能与阻滞细胞周期，上调促凋亡蛋白和下调凋亡抑制蛋白有关。

胰腺肿瘤； 受体，表皮生长因子； 细胞凋亡； 埃罗替尼

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜糖蛋白，其介导的信号转导途径涉及细胞的生长、分化、增殖及代谢调节等多个方面。胰腺癌的EGFR表达明显高于正常胰腺组织，并与胰腺癌的增殖、浸润和转移及预后关系密切[1-2]。

埃罗替尼(erlotinib)是一类EGFR酪氨酸激酶小分子抑制剂，已批准作为非小细胞肺癌(NSCLC)的二线临床治疗药物。其对胰腺癌细胞有明显的抑制作用，但作用机制尚不明确。本文观察埃罗替尼对人胰腺癌细胞BxPC3增殖、凋亡和细胞周期的影响，探讨其可能的作用机制。

材料和方法

一、细胞生长抑制检测

采用MTT法。人胰腺癌细胞株BxPC3购自中国科学院上海细胞生物研究所。取对数生长期BxPC3细胞，以每孔5×1030个接种于96孔培养板，常规培养24 h，分别加入DMSO溶解的1、5、10、50、100 μmol/L的埃罗替尼(南京德宝生化器材有限公司)继续培养24、48、72、96 h，每孔加入MTT 100 μg，继续孵育4 h，加入150 μl DMSO，振荡混匀后以酶标仪测定A490值。每个浓度设4个复孔，设空白对照和不予药物干预的对照组。细胞存活率=(实验组A490-空白对照A490)/(对照组A490-空白对照A490)×100%。

二、细胞凋亡和细胞周期检测

采用流式细胞仪分析。取对数生长期BxPC3细胞以无血清培养液培养24 h，分别加0、50、100 μmol/L埃罗替尼继续培养48 h，收集细胞，制成1×106/ml的单细胞悬液，与含1%RNA酶的Tris-HCL缓冲液共同孵育10 min，碘化丙啶(PI)染色，200目尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。

另取对数生长期BxPC3细胞接种于含玻片的12孔培养板，设0、50、100 μmol/L埃罗替尼3组培养48 h， PBS轻洗后多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明书操作。高倍显微镜下计数1000个细胞中所含的凋亡细胞，凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

三、细胞的凋亡形态观察

收集上述培养48 h的3组细胞，固定、脱水、包埋、切片、染色后透射电镜(CM120，Philips)观察。

四、bcl-2、bax、bcl-xl、bak mRNA的表达检测

应用5、50、100、200 μmol/L埃罗替尼处理 BxPC3细胞48 h后收集细胞，以Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，行RT-PCR。bcl-2上游5′-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3′，下游5′-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3′，产物458 bp；bax上游5′-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3′，下游5′-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3′，产物289 bp；bcl-xl上游5′-TTGGACAATGGACTGGTTG-3′，下游5′-GTAGAGTGGATGGTCAGTG-3′，产物765 bp；bak上游5′-TGAAAAATGGCTTCGGGGCAAGGC-3′，下游5′-TCATGATTTGAAGAATCTTCGTACC-3′，产物642 bp；内参GAPDH上游5′-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3′，下游5′-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3′，产物408 bp。PCR反应条件：94℃ 5 min， 94℃ 1 min、54℃ 1 min(GAPDH为 56 ℃)、72℃ 1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经电泳分离，GeneGenius凝胶成像分析系统扫描。

五、统计学分析

结 果

一、BxPC3细胞增殖的变化

作用72 h后，1、5、10、50、100 μmol/L埃罗替尼组细胞存活率分别为(90.25±2.62)%、(75.0±7.11)%、(69.75±5.97)%、(53.5±3.87)%和(40.75±2.98)%，100 μmol/L与1 μmol/L组比较具有统计学意义(Plt;0.01)。50 μmol/L埃罗替尼处理BxPC3后24、48、72、96 h的细胞存活率分别为(74.0±4.08)%、(78.25±8.53)%、(51.12±1.31)%、(49.50±1.29)%，72、96 h组较24、48 h组抑制作用显著增加(Plt;0.01)。

二、BxPC3细胞凋亡和细胞周期的变化

应用流式细胞仪分析法，0、50、100 μmol/L埃罗替尼组细胞凋亡率分别为(6.2±1.1)%、(11.0±1.1)%、(13.2±2.0)%；TUNEL法分别为(3.6±0.5)%、(14.9±1.2)%、(16.5±1.0)%，药物处理后细胞凋亡显著增加(Plt;0.01)，但两浓度组之间无显著差异(Pgt;0.05)。相差显微镜下可见用药组细胞有核固缩、核碎裂改变。

0、50、100 μmol/L埃罗替尼组G0/G1期细胞分别为(63.3±1.0)%、(73.4±1.3)%、(75.2±1.5)%，药物处理使细胞周期阻滞于G0/G1期(Plt;0.01)，但两药物组间无显著差异。

三、BxPC3细胞超微结构的改变

50 μmol/L 埃罗替尼处理细胞48 h后，细胞明显缩小。胞膜光滑完整，部分细胞可见泡状突起；细胞器结构紊乱、肿胀；胞质密度增加、浓染，出现大量空泡；核膜尚完整，但核内容物密集皱缩，染色质凝聚成块并边聚，形成一个或多个月牙小体(图1)。

图1对照组(A)、50 μmol/L 埃罗替尼组(B、C)细胞的透射电镜观察(×8000)

四、BxPC3细胞bcl-2、bax、bcl-xl、bak mRNA表达的变化

埃罗替尼可明显抑制BxPC3细胞bcl-2、bcl-xl mRNA 的表达(Plt;0.01)，轻微上调bax mRNA的表达(Plt;0.05)，但不影响bak mRNA的表达(图2)。

讨 论

EGFR及其下游的信号分子(Ras-Raf-MEK-ERK轴)与胰腺癌的关系日益受到重视。针对EGFR的信号转导系统设计和合成特异性的EGFR抑制物，可望对胰腺癌的防治开辟新的途径。埃罗替尼属于喹唑啉类选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，在临床前期和Ⅰ、Ⅱ期的试验中被证明对胰腺癌有效[3]，埃罗替尼联合化疗治疗胰腺癌的Ⅲ期临床试验研究也在进行之中[4]。虽然埃罗替尼体外对不同的胰腺癌细胞系均有明显的抑制作用[5]，但对其作用机制所知较少。

M：marker、1～5分别为200、100、50、5、0 μmol/L埃罗替尼组

本研究结果显示，埃罗替尼对体外培养的BxPC3细胞生长表现出抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。埃罗替尼对BxPC3细胞的半数抑制浓度(IC50)约为50 μmol/L，与Durkin等[5]的结果一致。

既往研究揭示，EGFR酪氨酸激酶抑制剂有调节细胞周期，诱导细胞凋亡，从而起到放化疗增敏的作用[6]。本结果显示，埃罗替尼处理胰腺癌细胞后，细胞凋亡比例明显增加，凋亡指数(AI)明显升高。电镜下可观察到肿瘤细胞明显的凋亡形态学改变，提示埃罗替尼是通过介导细胞凋亡而抑制细胞增殖的。此外，埃罗替尼可以使胰腺癌细胞生长停滞在G0/G1期，减少有丝分裂细胞数量，提示细胞周期的阻滞也是埃罗替尼抗肿瘤生长的机制之一。

bcl家族在细胞凋亡中起重要作用，bcl-2和bcl-xl为抗凋亡基因，bax和bak为促凋亡基因。本研究结果显示，埃罗替尼处理后，BxPC3细胞显著下调bcl-2 mRNA和bcl-xl mRNA的表达,轻微上调bax mRNA的表达，表明埃罗替尼通过上调促凋亡基因和下调凋亡抑制基因而增加细胞对凋亡的敏感性。

[1] Ueda S,Ogata S,Tsuda H,et al. The correlation between cytoplasmic overexpression of epidermal growth factor receptor and tumor aggressiveness:poor prognosis in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma.Pancreas,2004,29:e1-e8.

[2] Bloomston M,Bhardwaj A,Ellison EC,et al.Epidermal growth factor receptor expression in pancreatic carcinoma using tissue microarray technique.Dig Surg,2006,23:74-79.

[3] De Jager J,Stebbing J. Erlotinib or capecitabine with gemcitabine in pancreatic cancer. Future Oncol,2006,2:161-163.

[4] Herbst RS. Erlotinib(Tarceva):an update on the clinical trial program.Semin Oncol,2003,30:34-46.

[5] Durkin AJ, Bloomston PM, Rosemurgy AS,et al. Defining the role of the epidermal growth factor receptor in pancreatic cancer grown in vitro. Am J Surg,2003,186:431-436.

[6] Baselga J,Arteaga CL. Critical update and emerging trends in epidermal growth factor receptor targeting in cancer. J Clin Oncol,2005,23:2445-2459.

2009-02-24)

(本文编辑：吕芳萍)

InvitroeffectoferlotinibonthegrowthofpancreaticcancercelllineBxPC3anditsmechanism

LUYing-ying,JINGDa-dao,WANGXing-peng,WUKai.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

JINGDa-dao,Email:jingdadao@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanism of erlotinib, an epidermal growth factor receptor inhibitor, on human pancreatic cancer cell lines BxPC3 in vitro.MethodsMethylthiazolyltetrazolium (MTT) assay was used to detected the proliferation of BxPC3 after exposure to erlotinib, apoptosis and cell cycle changes were studied by flow cytometry and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling assay (TUNEL). The expressions of bcl-2 mRNA, bax mRNA, bcl-xL mRNA and bak mRNA were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsErlotinib inhibited BxPC3 cells growth in a dose and time dependent manner in vitro. The cell viabilities in erlotinib 1μmol/L and 100 μmol/L groups 72 h later were (90.25±2.62)% and (40.75±2.98)%, and the difference was statistically significant (Plt;0.01). The cell viability in erlotinib 50 μmol/L groups 24 h and 96 h after BxPC3 exposure were (74.0±4.08)% and (49.50±1.29)%, and the difference was statistically significant (Plt;0.01). Cell apoptosis rate in erlotinib 50 μmol/L group was(11.0±1.1)%, which was significantly higher than (6.2±1.1)% in control group (Plt;0.01). G0/G1cell accounted for (73.4±1.3)% of all the cells, which was significantly higher than (63.3±1.0)% in control group. With transmission electron microscope, the morphology of BxPC3 cells showed typical apoptosis and apoptotic body. The expressions of bcl-2 mRNA, bcl-xl mRNA were down-regulated, while the expression of bax mRNA was slightly up-regulated, and the expression of bak mRNA was not affected.ConclusionsThe growth of BxPC3

cells could be suppressed by erlotinib and possible mechanisms involved blocking cell cycle, up-regulating apoptosis proteins and down-regulating apoptosis inhibitor proteins.

Pancreatic neoplasms; Receptor, epidermal growth factor; Apoptosis; Erlotinib

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.010

200080 上海，上海交通大学附属第一人民医院消化内科

靖大道，Email：jingdadao@medmail.com.cn