p15INK4B基因对人胰腺癌细胞系BxPC3增殖的影响

张学彦 刘志强 景德怀 关景明 刘伟

·论著·

p15INK4B基因对人胰腺癌细胞系BxPC3增殖的影响

张学彦 刘志强 景德怀 关景明 刘伟

目的探讨p15INK4B(p15)基因转染对人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖的影响。方法采用脂质体将pCDNA3.1(+)-p15质粒及阴性对照pCDNA3.1(+)-neo质粒转染BxPC3细胞，以亲本细胞作为对照组。应用RT-PCR检测细胞p15 mRNA表达；Western blotting检测细胞p15蛋白表达；MTT法检测细胞增殖；透射电镜观察细胞超微结构变化；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果p15转染组细胞恢复p15 mRNA和蛋白表达。培养第2天生长被抑制，至第7天，生长抑制率达47.9%。G0/G1期细胞占(61.56±3.96)%，显著高于空质粒转染组的(47.44±6.35)%和对照组的(49.22±7.23)%(Plt;0.05)。出现明显的G1凋亡峰，细胞凋亡率为(5.27±1.04)%，显著高于空质粒转染组的(0.11±0.06)%和对照组的(0.09±0.07)%(Plt;0.05)。透射电镜观察到p15转染组发生细胞凋亡。结论体外p15基因转染可以抑制人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖，并能诱导其凋亡。

胰腺肿瘤； 转染； 周期素依赖激酶抑制剂p15

p15INK4B(简称p15)是近年来发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CKI)家族中的一个新成员,在胰腺癌发生过程中经常失活[1]。为探讨恢复p15表达能否抑制人胰腺癌细胞的增殖，本研究将p15转染到人胰腺癌细胞系BxPC3中，观察其对胰腺癌细胞生长的影响。

材料和方法

一、材料

真核表达质粒pCMV5-p15由北京师范大学生命科学学院-教育部细胞增殖与调控重点实验室柳惠图教授惠赠，我实验室先期将其亚克隆至有真核筛选标志新霉素抗性基因(neo)的质粒pCDNA3.1(+)上，称为pCDNA3.1(+)-p15质粒[2]。BxPC3细胞株购自中国科学院上海细胞所。Trizol试剂盒是Gibco公司产品，Taq酶为上海生工公司产品，逆转录试剂盒、限制性内切酶、转染级质粒中提试剂盒是Promega公司产品。p15小鼠抗人单抗是Neo Markers公司产品，辣根酶标山羊抗小鼠IgG为北京中杉金桥公司产品。 actin beta(ACTB)抗体和Western blotting发光试剂是Santa Cruz公司产品。脂质体Lipofectamine2000购于Invitrogen公司。引物由上海生工公司合成。上海生工公司进行质粒测序。

二、p15质粒转染BxPC3

人胰腺癌BxPC3细胞系在37℃、5% CO2饱和湿度条件下，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养传代，收集对数生长期细胞。

提取pCDNA3.1(+)-p15，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，PCR扩增片段鉴定正确后用pCDNA3.1(+)载体的测序引物T7测序验证明确后扩增大肠杆菌，并抽提质粒。采用Lipofectamine2000脂质体将pCDNA3.1(+)-p15质粒转染BxPC3细胞，为p15转染组；用空质粒pCDNA3.1(+)-neo转染BxPC3细胞，为阴性对照组；未转染的BxPC3细胞为空白对照组。每组3个样本。

三、细胞p15 mRNA和蛋白的检测

p15 mRNA表达采用RT-PCR检测。采用Trizol提取细胞总RNA。逆转录cDNA反应体系20 μl,含随机引物0.5 μg、逆转录酶200 U、RNA 1.0 μg、dNTP 0.5 mmol/L、RNasin 20 U，37℃ 60 min，95℃ 5 min。

PCR反应体系25 μl,含Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.5 mmol/L、cDNA 2 μl、TaqDNA合成酶2 U、上下游引物各0.4 μmol/L。p15 上游引物5′-CCAGAA-GCAATCCAGGCGCG-3′，下游引物5′-CGTTGG-CAGCCTTCATCG-3′，产物753 bp，退火58℃；内参β-actin上游引物5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAG-ATCAT-3′，下游引物5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-AGCGA-3′，产物100 bp，反应35个循环。产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，照相。

p15蛋白表达采用常规Western blotting检测，以表达p15蛋白的Hela细胞为阳性对照。

四、细胞增殖检测

采用MTT法。取对数生长期细胞，按3×103个细胞/孔接种96孔板，每孔加5 g/L MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h，每孔加180 μl二甲基亚砜，振荡10 min， 测定A490值，每隔1天测定一次，连续测定7 d，绘制细胞生长曲线。

五、细胞凋亡检测

采用流式细胞仪检测。取各组1×106个细胞，加入70%冷乙醇4℃固定24 h，用50 mg/L RNase 37℃处理30 min，加100 mg/L碘化丙啶避光染色30 min,上流式细胞仪测定。

六、细胞超微结构观察

取各组1×106个细胞，1500 r/min离心10 min，加入3%戊二醛固定一周，送透射电镜检测。

七、统计学处理

结 果

一、BxPC3细胞p15 mRNA和蛋白的表达

亲本代BxPC3细胞不表达p15 mRNA和蛋白。p15转染组细胞表达p15mRNA，扩增出753 bp 的目的条带(图1)；表达p15蛋白，存在分子质量为15 000的目的条带(图2)。空质粒转染阴性对照组和未转染空白对照组均不表达p15 mRNA和蛋白。

二、细胞增殖的变化

空质粒转染组和未转染组细胞增殖基本一致。而转染p15基因后BxPC3细胞增殖从第2天起开始被抑制，生长抑制率为17.4%，随时间延长抑制率逐渐升高，第7天时达47.9%(图3)。

1．Marker KL2000；2．BxPC3细胞；3．p15转染细胞

1．Marker；2．阳性对照Hela；3．p15转染组；4．空质粒转染组；5．BxPC组

图2各组细胞p15蛋白检测

三、细胞周期变化

图3 各组BxPC3细胞生长曲线

p15转染组的G0/G1期细胞占(61.56±3.96)%，显著高于空质粒转染组的(47.44±6.35)%和未转染组的(49.22±7.23)% (Plt;0.05)；S期细胞占(21.75±1.99)%，显著低于空质粒转染组的(35.25±3.97)%和未转染组的(36.01±1.54)% (Plt;0.01)。p15转染组出现明显的G1凋亡峰，细胞凋亡率为(5.27±1.04)%，显著高于空质粒转染组的(0.11±0.06)%和未转染组的(0.09±0.07)%(图4，Plt;0.05)。

四、细胞超微结构的改变

空质粒转染组细胞生长状态较好，未见凋亡形态学改变，核浆比例大，圆形核仁多，细胞表面绒毛密集排列，双层核膜结构清晰，胞质内有丰富的游离核蛋白体。p15转染组可见部分细胞发生凋亡，细胞体积变小，表面绒毛消失，核固缩，染色质形成高密度斑块，胞质内出现大量脂肪滴颗粒，部分线粒体出现髓样变，游离核糖体减少(图5)。

1.BxPC3组；2.空质粒转染组；3. p15转染组

1.BxPC3组；2.空质粒转染组；3. p15转染组

讨 论

p15是近年来发现的一类CKI分子，定位于9号染色体9p21区，这一位点易发生缺失、突变和甲基化，从而导致恶性肿瘤发生。p15被认为是除了p53、Rb之外的CKI类重要抑癌基因[3]。p15的抑癌机制与细胞周期调控密切相关，它能直接作用于CyckinD1/CDK4复合物中的CyclinD1，从而影响CDK4激酶的活性，导致pRb磷酸化水平下降，使细胞被阻滞在G1期。其次，癌基因c-myc的产物Myc与Max结合形成一个转录因子，具有促进细胞转化、诱导肿瘤发生的作用，而p15高表达能引起c-Myc蛋白表达水平下降。第三，原癌基因c-fos参与形成转录因子AP-1，AP-1能激活生长类蛋白基因的转录,对细胞周期起正调作用[4]，而p15高表达可引起c-fos蛋白表达水平的下降。此外，p15失活在恶变中所起的重要作用可能与其引起Cyckin-Rb通路失控和控制细胞增殖的作用丧失直接相关。

胰腺癌时Smad4失活，p15是Smad4的关键下游效应基因[5]，Smad4和p15功能丧失就导致了TGF-β丧失诱导CDK抑制因子的作用[6]。Hitomi等[7]认为，p15是组蛋白去乙酰基(Histone deacetylase,HDAC)抑制物的重要分子靶点，而HDAC抑制物能将人肿瘤细胞阻滞于G1期，并能激活细胞周期依赖激酶抑制物p21WAF1。

p15基因在胰腺癌中有较高频率的失活，失活的主要机制包括纯合缺失及甲基化[1,8]，p15基因有可能成为胰腺癌基因治疗的新目的基因。文献报道[2-4，9-11]，p15基因转染食管癌、黑色素瘤细胞、肝癌、胆管癌及神经胶质瘤细胞均能抑制细胞生长,有关p15转染对胰腺癌细胞增殖是否有抑制作用尚无研究报道。本实验结果显示，BxPC3细胞在转染p15基因而恢复p15蛋白高表达后，其增殖明显受到抑制，细胞被阻滞在G1/S期，出现凋亡特征性的亚G1峰，提示p15转染对胰腺癌有明显的生长抑制作用，并能诱导细胞凋亡，为胰腺癌的基因治疗提供了一种新途径。p15转染的优点是其片段长度小，克隆和转染操作比较方便，可能是具有应用前景的基因治疗的较好的靶基因。

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2009-02-18)

(本文编辑：吕芳萍)

Inhibitoryeffectofp15INK4BgeneonproliferationofhumanpancreaticcancercelllineBxPC

ZHANGXue-yan,LIUZhi-qiang,JINGDe-huai,GUANJing-ming,LIUWei.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

ZHANGXue-yan,Email:zxycxw@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of p15INK4B(p15) gene transfection on the proliferation of pancreatic cancer cell line BxPC3.MethodsIn p15 transfection group, pCDNA3.1(+) p15 was transfected into BxPC3 cell by the vector of Lipofectamine2000. In empty plasmid transfection group, pCDNA3.1(+) neo was transfected into BxPC3 cell with the same method as a blank control group. In non-transfection group, the BxPC3 cell was not transfected as a negative control group. The p15 mRNA expressions were assayed by RT-PCR, and p15 protein expressions were assayed by Western blot. The proliferation was determined by MTT assay, ultra-structure changes were measured by transmission electron microscope. Cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry.ResultsIn the pCDNA3.1(+) p15 transfection group, the expression of p15 mRNA and protein were resumed. Since the 2nd day of culture, the growth of pCDNA3.1(+) p15 transfection group was inhibited, till the 7th day, the inhibitory rate was 47.9%, G0/G1phase cell accounted for (61.56±3.96)% of all the cells, which was significantly higher than (47.44±6.35)% of the black control groups and (49.22±7.23)% of the negative control group(Plt;0.05). G1apoptosis peak occurred and the apoptosis rate was (5.27±1.04)% in pCDNA3.1(+) p15 transfection group, which was significantly higher than (0.11±0.06)% of the black control groups and (0.09±0.07)% of the negative control group (Plt;0.05). Apoptosis was also observed by transmission electron microscope in the pCDNA3.1(+)-p15 transfection group cells.ConclusionsAfter p15 gene transfection, BxPC3 cell proliferation could be significantly inhibited and apoptosis could be induced.

Pancreatic neoplasms; Transfection； Cyclin-dependent kinase inhibitor p15

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.007

黑龙江省科技计划攻关基金重点项目(GB05C401-09),黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11521191),黑龙江省卫生厅科研项目(2007-304)

150086 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属二院消化科

张学彦，Email:zxycxw@sina.com