一株降解甲氰菊酯的光合细菌的分离鉴定及其降解酶初步分析

罗源华　张战泓　刘　勇　张松柏　张德咏　罗香文　成飞雪

摘要:从某农药厂污泥中筛选分离出一株高效降解甲氰菊酯(Fenpropathrin)的光合细菌,研究了其降解特性及生物学特性。根据分离菌株的细胞形态结构、活细胞光吸收特征、生理生化特征及其16S rDNA序列同源性鉴定降解菌;气相色谱法测定该菌降解甲氰菊酯的能力;采用超声波破碎法提取该菌降解粗酶,利用(NH4)2SO4分段盐析并测定酶活性。结果表明:PSB07-14属红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.);该菌以共代谢方式降解甲氰菊酯,对甲氰菊酯的最高耐受浓度为800 mg/L,降解最佳条件为:30～35 ℃、pH6～7,光照培养15 d对600 mg/L甲氰菊酯降解率达48.41%。降解酶测定结果表明:30%～60%(NH4)2SO4沉淀的蛋白降解活性最高。

关键词:甲氰菊酯;红假单胞菌;生物降解;降解酶

中图分类号:X172文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0001-05

Isolation, Identification of Fenpropathrin-degrading Strain PSB07-14 and Preliminary Analysis of Its Degradation Crude Enzyme

LUO Yuan-hua1,ZHANG Zhan-hong3,LIU Yong1,2,ZHANG Song-bai1,2,ZHANG De-yong1,2,LUO Xiang-wen1, CHENG Fei-xue1

(1.Hunan Plant Protection Institute,Changsha,Hunan 410125,China;2. Branch of Longping,Graduate College,Central South University,Changsha,Hunan 410125,China;3. Hunan Vegetable Institute,Changsha,Hunan 410125,China)

Abstract:A photosynthetic bacterial strain PSB07-14, with degradability of fenpropathrin, was isolated and identified as Rhodopseudomonas sp. based on its morphology, physiology and homology of 16S rDNA sequence. The degrading characteristics showed the optimum conditions of degrading fenpropathrin were 30～35 ℃, pH 6～7, respectively. This strain could grow in the media supplied with fenpropathrin up to 800 mg/Land degrade fenpropathrin by co-metabolic way. The degradation rate of fenpropathrin was up to 48.41% in a concentration of 600 mg/L within 15 d. The degradation crude enzyme was extracted and subsided by (NH4)2SO4, the results of subsiding enzyme activity showed the highest enzyme activity appeared in the subsiding of 30%～60%(NH4)2SO4.

Key words: fenpropathrin;Rhodopseudomonas sp. PSB07-14;biodegradation;degradation enzyme

甲氰菊酯,化学名称2-氰基-3-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷酸酯,商品名灭扫利,对鳞翅目、同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫有效,同时对多种害螨的成螨、若螨和螨卵有一定的防治效果[1],适用于棉花、蔬菜、果树、玉米、大豆、烟草、茶叶等作物以及林木、家畜、卫生和仓储等害虫防治,对一些农作物还有促进生长、增加产量、改善品质的作用。

虽然甲氰菊酯对高等动物毒性中等,在试验剂量内对试验动物未发现致畸、致突变和致癌作用。但是,对鱼类等水生生物、蜜蜂、家蚕等高毒,对光、热、潮湿稳定,在环境中的半衰期较长,长期使用,环境中大量残留,会带来严重的环境污染和生态风险。这迫使我们寻找一种切实有效的方法来解决这一难题 [2,3]。以生物修复(Bioremediation)为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生产环境中的农药残留物提供了希望,该技术具有高效、无毒、无二次污染的特点,而且经济实用,操作简便,目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。国内外有很多关于农药残留降解菌研究的报道,由于菊酯类农药在20世纪80年代才在我国广泛使用,对该类农药的研究起步较晚,对拟除虫菊酯类农药的降解菌报道相对较少[3,4]。因此,筛选更多类型的甲氰菊酯高效降解菌,对甲氰菊酯残留的生物修复研究和应用具有十分重要的意义。

笔者从某农药厂污泥中分离到一株能降解甲氰菊酯的光合细菌PSB07-14,对其降解甲氰菊酯的特性进行了研究。该研究为利用光合细菌降解甲氰菊酯残留及其降解机理、克隆降解酶基因打下了基础。

1材料和方法

1.1培养基、试剂和主要仪器

光合细菌(PSB)培养基:MS培养基添加0.15%酵母膏,参照文献[5];选择培养基:在PSB培养基中加入一定浓度的甲氰菊酯;固体培养基:在培养基中加入1.5%的琼脂。

主要试剂:40 %甲氰菊酯乳油,海南正业化工有限公司惠赠;98 %甲氰菊酯标准品购自天津东方绿色技术发展有限公司;其它农药残留检测试剂均为色谱纯。

主要仪器:农药残留检测在湖南省植物保护研究所农药残留检测室进行。6890N气相色谱仪 (Agilent, USA)、扫描电子显微镜(JEXL-230,日本电子公司)、分光光度计(Tu-1901,北京普析通用仪器有限责任公司)、光照培养箱(GZP-350,上海精宏实验设备有限公司)。

1.2培养条件

光合细菌培养采用130 mL的血清瓶。培养条件(除特别说明外):厌氧光照培养,(30±2)℃,2 000 lx光照培养6～7 d;黑暗好氧培养,黑暗条件下,(30±2)℃,培养6～7 d。每天摇瓶混匀1次。

1.3降解菌的分离、筛选

将采自某农药厂的污泥2.0 g加入120 mL PSB培养基中,光照培养7 d后,取1%菌液接种到含甲氰菊酯100 mg/L的选择性液体培养基中,光照培养7 d,取300 μL菌液稀释涂布到选择性固体培养基中,挑取菌落形态不同的菌,分别接种到含甲氰菊酯100 mg/L选择性液体培养基中,光照培养7 d,取1%分别接种到含甲氰菊酯200,400,600,800,1 000 mg/L选择培养基中,15 d后检测培养基农药浓度,以含相同浓度的甲氰菊酯,相同培养条件不接种细菌的培养基为对照。选择降解率最大的细菌进行后续研究,命名为PSB07-14,后续试验中1 mL菌液中约含活细胞109个。

1.4菌种的鉴定

1.4.1电镜样品制备及观察将活的细菌滴到具膜载网上,然后进行磷钨酸染色,TEM(transmission- scanning electron microscope)观察拍照。

1.4.2吸收光谱的测定取1.5 mL培养5 d的光合细菌培养液,8 000 r/min离心洗涤3次,用0.9 %生理盐水重悬浮,在分光光度计上于200～900 nm扫描。

1.4.3菌株的生理生化特征的测定见参考文献[6]。

1.4.4菌体16S rDNA序列的测定及同源性分析细菌基因组提取采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。以所提的细菌总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物扩增[5],PCR反应体系(50 μL):10×PCR Buffer 2.5 μL;MgCl2(25 mmol/L) 2 μL;dNTP(10 mmol/L) 2 μL;引物Bpf/Bpr(25 μmol/L) 各0.5 μL;Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL;双蒸水 43 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循环30次;72 ℃ 10 min。反应完成后,经1%琼脂糖电泳,检测扩增片断的大小和特异性。PCR产物纯化后,委托上海生工生物工程公司测序。将PSB07-14测得的16S rDNA序列在Genbank中利用blast进行比对,比较不同细菌间的相似性。

1.5甲氰菊酯含量的测定

整瓶培养液,用正己烷萃取3次,每次用量分别为40,40,30 mL。氮吹仪上吹干,然后用正己烷溶解并定容至10 mL,接着加入无水硫酸钠脱水。气相色谱测定其含量[4]。以98 %甲氰菊酯标样定性定量,所有数据为3次重复平均值。

测试条件:气相色谱仪型号Agilent 6890N,色谱柱型号为HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm),采用程序升温法:毛细管柱起始温度160 ℃,保持5 min,10 ℃/min升至200 ℃,保持1 min,10 ℃/min升至280 ℃,保持8 min,检测器(μECD)温度320 ℃,进样口温度250 ℃,载气为N2(纯度99.999 9 %),流量1 mL/min。进样量均为1 μL。

降解率的计算方法:降解率=(1-C1/C0)×100%

其中,C1为降解菌处理甲氰菊酯残留浓度(mg/L),C0为对照处理甲氰菊酯残留浓度(mg/L)。

1.6 降解酶的提取与盐析

15 mL离心管加入10 mL培养7 d的PSB07-14菌液,8 000 r/min离心2 min,倒去上清液,重复1次,收集菌细胞,倒去上清液,加入等体积的PBS(pH7.2)缓冲液,降解粗酶的提取采用超声波破碎仪破碎菌体细胞[7],12 000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液,考马氏亮蓝法测定蛋白的浓度[8],用PBS缓冲液调整蛋白浓度为10 mg/L做后续实验。取50 mL粗酶液,加入(NH4)2SO4盐析,静置10 min,离心收集沉淀,PSB(pH7.2)缓冲液溶解,并调整蛋白浓度为1 mg/mL[8]。酶活力测定参照文献[7],本试验的1个酶活力单位(U)定义为在本试验条件下1 min内甲氰菊酯减少的微摩尔数。

2结果与分析

2.1菌株鉴定

2.1.1培养特征和活细胞光吸收特征培养结果表明,PSB07-14最佳生长温度为30～35 ℃、pH6.5～7.5,具有红色培养物、黑暗好氧生长慢以及耐盐低于3%的Rhodopseudomonas的特征[6]。活细胞光吸收结果表明(图1),该菌含有细菌叶绿素a及类胡萝卜素[5],表明该菌属于紫色非硫细菌。

2.1.2形态结构和生理生化特征图2的电镜结果表明,PSB07-14为杆状,大小为0.6～1.0 μm×2.4～3.1 μm,端生鞭毛,以二分裂方式繁殖。生理生化分析结果表明(表1):G-,V-P反应阴性,甲基红反应阴性,不能利用淀粉,H2S反应阴性;可以利用多种小分子的有机酸生长,也能利用部分氨基酸和醇类化合物进行生长。PSB07-14的形态结构和生理生化特征与Rhodopseudomonas基本一致[6]。

2.1.316S rDNA序列分析PSB07-14测定的16S rDNA序列长度为1 429 bp (Genbank accession No.FJ798824),Blast结果表明,在Genebank中,与Rhodopseudomonas palustris strain HZ-1 (EU703955)和Rhodopseudomonas sp. TUT3625 (AB250616) 的同源性分别为98%和97%。

2.1.4鉴定结果根据Bergeys Manual of Determinative Bacteriology[6],将PSB07-14鉴定为Rhodopseudomonas sp.。

2.2菌株对甲氰菊酯的降解

2.2.1对甲氰菊酯的耐受浓度在120 mL PSB液体培养基中,加入5 mL菌液和适量甲氰菊酯,使培养基中甲氰菊酯终浓度为200,400,600,800,1 000 mg/L,光照培养,第15 天观察PSB07-14的生长情况。结果如表2示,PSB07-14耐受甲氰菊酯的最大浓度为800 mg/L。

2.2.2对甲氰菊酯的降解120 mL的PSB液体培养基中加入5 mL PSB07-14和适量甲氰菊酯,使其最终浓度为600 mg/L,光照培养15 d取样测定甲氰菊酯的残留量,以含600 mg/L甲氰菊酯培养液为对照。甲氰菊酯在光照下,经过15 d有一定量的降解,可见光照对甲氰菊酯有一定的降解效果,但作用并不是很大(4.13%)。PSB07-14在600 mg/L甲氰菊酯培养液中培养15 d,对甲氰菊酯的降解率为48.41%(表3)。

2.2.3最佳降解条件在pH为5,6,7,8,9,10的120 mL的PSB培养基中,加入5 mL的PSB07-14菌液和适量甲氰菊酯,其最终浓度600 mg/L,光照培养15 d后取样,样品经萃取后检测甲氰菊酯残留量。结果表明(图3),pH在6～8之间,PSB07-14的降解效能都比较好,最适pH为7。

在120 mL含甲氰菊酯600 mg/L的PSB培养基中,加入5 mL的PSB07-14菌液,不同温度下,光照培养15 d后测定甲氰菊酯残留量。图4表明,PSB07-14在25～35 ℃之间,具有良好的甲氰菊酯降解能力,在35 ℃降解能力最好。温度过高或过低都显著影响菌株的降解能力,当温度低于25 ℃或高于45 ℃,菌株几乎丧失降解能力。

2.2.4菌株对甲氰菊酯的共代谢特点PSB07-14在以甲氰菊酯为唯一碳源的PSB培养基中不生长(表4),但在有其他碳源(酵母膏)存在时可以降解甲氰菊酯,表明PSB07-14是以共代谢的方式降解甲氰菊酯[9]。

2.3分段盐析粗蛋白降解活性

分段盐析粗蛋白降解活性表明,30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27 U/L,大大高出0～30%、60%～80%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白的活性(表5)。

3讨 论

通过富集培养法分离出甲氰菊酯降解菌PSB07-14,生理生化方法和16S rDNA序列同源性将其鉴定为Rhodopseudomonas sp.。在农药残留的降解菌研究中,光合细菌的研究报道相对较少;光合细菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。近年来,对光合细菌的应用研究获得了很大的进展。研究表明,光合细菌在种植、养殖、新能源开发利用以及医药方面具有十分广阔的前景[10-13]。在环境治理方面,光合细菌可以有效地处理有机废水[14],净化水质[15],降解芳香族化合物[13]。在农药降解方面,光合细菌可以有效地降解有机磷农药[5]、 硫代磷酸酯类农药[16]。而且光合细菌具有很好的促进作物生长和提高作物抗逆性的作用[17],因此,筛选光合细菌降解菌具有良好的应用前景。

PSB07-14对高浓度的甲氰菊酯具有良好的降解效果,在600 mg/L甲氰菊酯培养液中培养15 d,对甲氰菊酯的降解率为48.41%。高于丁海涛等[18]分离的降解菌降解速率以及笔者先前分离的光合细菌株PSB07-19[19],与洪源范等[9]分离的降解菌降解速率相当。PSB07-14降解甲氰菊酯的最佳条件与该菌生长的最佳条件基本一致,表明该菌具有潜在的实际应用价值。

PSB07-14不能以甲氰菊酯作为唯一碳源,只能以共代谢的方式降解甲氰菊酯。表明PSB07-14对甲氰菊酯的降解作用是一种酶促反应,该结果与洪源范等[9]的研究结果一致。

PSB07-14降解酶分段盐析结果表明,在30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27 U/L,该研究为降解酶的分离纯化提供了参考。其降解酶的研究以及降解酶基因的克隆是下一步的工作方向。

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